Poslední úprava: RNDr. Irena Lichá, CSc. (31.05.2016)
Praktikum doplňuje přednášku „Rekombinantní mikroorganismy v biotechnologiích“ o praktické úlohy pokročilé
kultivací mikroorganizmů, které budou studenti jak samostatně provádět, tak vyhodnocovat. Praktikum je určeno
pro magisterské studenty oboru Mikrobiologie i dalších oborů. Praktikum probíhá v Mikrobiologickém ústavu AV
ČR.
Poslední úprava: RNDr. Mgr. Andrea Palyzová, Ph.D. (10.06.2016)
Practicum supplements the lecture "Recombinant microorganisms in biotechnology" about practical tasks advanced by cultivation of microorganisms in stirred bioreactor. Students will evaluate and deal with experiments individually. Practical course is aimed for graduate students of Microbiology and other disciplines. Practical course takes place in the Microbiological Institute of the Academy of Science.
Literatura
Poslední úprava: RNDr. Irena Lichá, CSc. (13.03.2019)
Literatura:
In vitro cultivation of microorganisms. BIOTOL (Project); Open Universiteit (Heerlen, Netherlands); Thames Polytechnic. Oxford ; Boston : Butterworth-Heinemann, 1992.
Barredo, J.-L. (Ed.). 2005. Microbial Processes and Products. In: Methods in Biotechnology, volume 18, Humana Press. https://doi.org/10.1385/1592598471
Glick B.R., Pasternak J.J., 2002. Principles and Applications of Recombinant DNA. In: Molecular Biotechnology. ASM Press.
Filloux, A., Ramos, J.-L. (Eds.). 2014. Pseudomonas Methods and Protocols. In: Methods in Molecular Biology, volume 1149, Humana Press, https://doi.org/10.1007/978-1-4939-0473-0.
Poslední úprava: RNDr. Irena Lichá, CSc. (08.08.2019)
zápočet je za aktivní účast na praktiku
Poslední úprava: RNDr. Michaela Schierová, Ph.D. (24.10.2019)
To get the credit, active participation in a practical course is required.
Sylabus -
Poslední úprava: RNDr. Mgr. Andrea Palyzová, Ph.D. (10.06.2016)
Experimentální část praktika kultivací zaměřeného na produkční bakteriální kmeny v kontinuálně míchaném bioreaktoru (CSTR)
1) Jednorázová vsádková fermentace v míchaném bioreaktoru - příklad produkce mikrobiálního produktu v uzavřeném systému, kdy všechny živiny budou v průběhu kultivace spotřebovávány, výsledkem bude akumulace biomasy a extracelulárního produktu.
Průběh a podmínky kultivace: pracovní objem 3L, doba kultivace 24h (monitoring exponenciální a stacionární fáze růstu), komplexní medium 1% hydrolyzát kaseinu, příprava dvoustupňového inokula (ověření Mn rezistence) kultivační podmínky v CSTR: aerace 3 NL/min, počáteční pH 7.0 (v průběhu kultivace neregulováno), frekvence míchání 300 rpm (udržováno po celou dobu kultivace), kultivační teplota 25°C, pO2 v průběhu kultivace neregulováno měřené parametry v průběhu kultivace: optická densita kultury, suchá hmotnost buněk, totální produkce extracelulárního produktu, specifická růstová rychlost, stanovení specifické produkce, stanovení produktivity (qp) a výtěžku (Yx/s), výpočet produkce volného pyoverdinu (ligandu) a komplexu ferripyoverdinu - spektrofotometrické stanovení absorbance supernatantu a výpočet množství pyoverdinu systémem dvou rovnic vycházejících z molárních extinkčních koeficientů pro pyoverdin a ferripyoverdin při dvou vlnových délkách (367 a 402 nm).
2) Přítokovaná fermentace v míchaném bioreaktoru - příklad kultivace rekombinantního vysoceexpresního bakteriálního systému, kdy živiny budou řízeně dávkovány v průběhu kultivace, rychlost přítoku zásobního roztoku substrátu je kontrolována koncentrací rozpuštěného kyslíku (pO2) mikroorganismus: rekombinantní bakterie - Escherichia coli RE3(pKA18) - produkční kmen pro periplasmatický enzym PGA (konstitutivní exprese genu) průběh a podmínky kultivace: pracovní objem 6L, definované minerální medium MCHGly, příprava dvoustupňového inokula kultivační podmínky v CSTR: aerace 6 NL/min, počáteční pH 7.0 a v průběhu kultivace udržováno pomocí 25% NH4OH, frekvence míchání 300 - 900 rpm - kaskáda pO2 pomocí otáček, kultivační teplota 28°C, pO2 udržováno na 20%, přítokovaná fáze - přítok substrátu je regulován koncentrací pO2 V měřené parametry v průběhu kultivace: optické density, specifické růstové rychlosti, suché hmotnosti buněk, totální aktivity enzymu, stanovení specifické aktivity enzymu, stanovení zbytkové koncentrace substrátu v průběhu vsádkové fáze zpracování vzorků na aktivitu - DSP pomocí ultrasonikace, French-Press, opakovaným zmrazováním a rozmrazováním buněk, kinetické stanovení aktivity kolorimetrickou metodou založenou na chromogenní reakci 6- aminopenicilánové kyseliny s p-dimethylaminobenzaldehydem (p-DAB).
Poslední úprava: RNDr. Michaela Schierová, Ph.D. (29.10.2019)
Experimental part of cultivation practice focused on production of bacterial strains in continuously stirred bioreactor (CSTR)
1) Single batch fermentation in a stirred bioreactor - example of microbial product production in a closed system, where all nutrients will be consumed during cultivation, resulting in accumulation of biomass and extracellular product.
2) Fed-fermentation in a stirred bioreactor - example of cultivation of recombinant high-expression bacterial system, where nutrients will be controlled in the course of cultivation, flow rate of substrate stock solution is controlled by dissolved oxygen concentration (pO2)
