Poslední úprava: Mgr. Tomáš Fér, Ph.D. (07.10.2019)
Praktické seznámení s metodami molekulárních markerů v DNA laboratoři Katedry botaniky. Studenti se nejprve naučí extrahovat DNA z rostlinného materiálu a optimalizovat PCR reakci. Ve druhé části si vyzkouší metodu PCR-RFLP na úsecích z chloroplastové DNA.
Poslední úprava: Mgr. Tomáš Fér, Ph.D. (07.10.2019)
The lectures/practicals are given in English if non-Czech speaking students are enrolled. A practical introduction to the methods of molecular markers in DNA lab at the Department of Botany. Students will learn methods of DNA extraction from the plant material and PCR optimization. In the second part PCR-RFLP method on chloroplast DNA is demonstrated.
Literatura -
Poslední úprava: Mgr. Tomáš Fér, Ph.D. (22.04.2012)
Weising K. et al. (2005): DNA fingerprinting in plants. Principles, methods, and applications. 2nd edition.
Caetano-Anollés G. & Gresshoff P.M. (1998): DNA markers. Protocols, applications, and overviews.
Hall B.G. (2001): Phylogenetic trees made easy.
Poslední úprava: Mgr. Tomáš Fér, Ph.D. (22.04.2012)
Weising K. et al. (2005): DNA fingerprinting in plants. Principles, methods, and applications. 2nd edition.
Caetano-Anollés G. & Gresshoff P.M. (1998): DNA markers. Protocols, applications, and overviews.
Hall B.G. (2001): Phylogenetic trees made easy.
Požadavky ke zkoušce -
Poslední úprava: Mgr. Tomáš Fér, Ph.D. (07.10.2019)
Vypracované protokoly k řešeným úkolům podle pokynů přednášejícího.
Poslední úprava: Mgr. Tomáš Fér, Ph.D. (07.10.2019)
Write out protocols from the practical part.
Sylabus -
Poslední úprava: Mgr. Tomáš Fér, Ph.D. (07.10.2019)
* 1. den - úvod do problematiky, metody studia DNA, rozdíly mezi jednotlivými typy markerů - extrakce DNA z rostlinného materiálu (CTAB metoda, komerční kit) - čerstvý i vysušený materiál - elektroforéza, příprava agarosových minigelů, použití DNA ladderů (žebříčků) - práce s dokumentačním systémem Kodak Gel Logic 100 - stanovení koncentrace extrahované DNA pomocí UV spektrofotometru (Nanodrop), ředění DNA
* 2. den - PCR amplifikace, příprava směsi pro reakci, metody optimalizace reakčních podmínek - zacházením s různými typy termocyclerů - vytváření nových programů, využití gradientového bloku pro optimalizaci PCR reakce - metoda PCR - optimalizace PCR amplifikace pomocí gradientového bloku - elektroforéza získaných PCR produktů a jejich visualizace - práce se softwarem pro analýzu gelů (KODAK 1D Image Analysis Software) - stanovení přibližné délky získaných PCR produktů
* 3. den - PCR amplifikace s použitím optimální teploty annealingu - štěpení získaných PCR produktů několika restrikčními enzymy, elektroforéza výsledku štěpení DNA
* 4. den - dominantní molekulární markery a jejich vyhodnocování - teorie - analýza cvičných gelů, získávání matice dat - hodnocení binární matice - program FAMD - výpočty diverzity, PCoA, stromy, sítě, AMOVA - FAMD, AFLPdat, SplitsTree
* 5. den - pokračování analýzy cvičných dat - Bayesovský modelový přístup - program STRUCTURE - vizualizace výsledků STRUCTURE analýzy - Structure-sum, Distruct
Poslední úprava: Mgr. Tomáš Fér, Ph.D. (07.10.2019)
* 1st day - introduction, methods of study of DNA, differences among molecular markers - DNA extraction from plant material (CTAB method, commercial kit) - fresh and dried material - electrophoresis, making agarose minigels, use of DNA ladders - working with documentation system Kodak Gel Logic 100 - determining of DNA concentration using UV spectrophotometer (Nanodrop), DNA dilution
* 2nd day - PCR amplification, making PCR premix, methods of PCR optimization - working with diverse termocyclers - making new PCR programs, use of gradient block for PCR optimization - PCR method - optimization using gradient block - electrophoresis of PCR bands and their visualization - working with the software for gel analysis (KODAK 1D Image Analysis Software) - estimation of the lengths of PCR bands
* 3rd day (PCR-RFLP) - PCR amplification using optimal annealing temperature - restriction of PCR bands with restriction endonucleases
* 4th day - dominant molecular markers and data evaluation - theory - analysis of test gels, preparing binary data matrix - evaluation of the data - FAMD software - diversity calculation, PCoA, trees, networks, AMOVA - FAMD, AFLPdat, SplitsTree
* 5th day - continue with data analysis - Bayesian model-based approach - STRUCTURE software - visualization of the STRUCTURE results - Structure-sum, Distruct
