PředmětyPředměty(verze: 850)
Předmět, akademický rok 2019/2020
  
Metody založené na fluorescenci jednotlivých molekul - MC260P135
Anglický název: Methods based on fluorescence of single molecules
Český název: Metody založené na fluorescenci jednotlivých molekul
Zajišťuje: Katedra fyzikální a makromol. chemie (31-260)
Fakulta: Přírodovědecká fakulta
Platnost: od 2019
Semestr: letní
E-Kredity: 3
Způsob provedení zkoušky: letní s.:
Rozsah, examinace: letní s.:2/0 Zk [hodiny/týden]
Počet míst: neomezen
Minimální obsazenost: neomezen
Stav předmětu: vyučován
Jazyk výuky: čeština
Garant: RNDr. Radek Šachl, Ph.D.
Vyučující: RNDr. Radek Šachl, Ph.D.
Výsledky anket   Termíny zkoušek   Rozvrh   
Anotace -
Poslední úprava: RNDr. Radek Šachl, Ph.D. (24.05.2019)
Fluorescenční spektroskopie založená na detekci jednotlivých molekul (single molecule fluorescence spectroscopy) zažila v nedávné době nebývale rychlý rozvoj a stala se tak jednou z nepostradatelných metod v oblasti biofyziky. Cílem tohoto kurzu je teoreticky seznámit posluchače s tímto oborem. Důraz je kladen především na porozumění fyzikálně-chemických principů, na nichž jsou tyto metody založeny. Užitečnost těchto fluorescenčních technik je demonstrována na mnoha praktických příkladech z oblasti biofyziky.
Literatura -
Poslední úprava: RNDr. Radek Šachl, Ph.D. (24.05.2019)

1. J. R. Lakowicz, Principles of fluorescence spectroscopy, Springer, 3rd edn., 2006.

2. B. Valeur, Molecular Fluorescence Principles and Applications, Wiley-VCH Verlag GmbH, New York, 2001.

Požadavky ke zkoušce -
Poslední úprava: RNDr. Radek Šachl, Ph.D. (24.05.2019)

Ústní zkouška v rozsahu přednášené látky

Sylabus -
Poslední úprava: RNDr. Radek Šachl, Ph.D. (24.05.2019)

1) Úvod do fluorescence: Jablonskiho diagram; absorpční a emisní spektra; fluorescenční značky; kinetika vyhasínání; fluorescenční decay; průměrná doba života; kvantový výtěžek fluorescence; zhášení fluorescence;   

2) Detekce jednotlivých molekul: principiální rozdíly vůči klasickému měření fluorescence ze souboru mnoha molekul; fotofyzika jednotlivých molekul; metody detekce fluorescence; konfokální versus wide-filed mikroskop; metoda TIRF (total internal reflection fluorescence); detekce různých proteinových konfigurací pomocí sm-FRET techniky; rotace a reorientace jednotlivých molekul;

3) Stopování jednotlivých molekul (Single particle tracking, SPT): difúze ve dvou rozměrech; náhodná procházka; MSD diagramy; různé módy difúze: volná, ‚hindered‘ a hop-difúze. Metody měření SPT; odvozené techniky: analýza svítivosti a TOCCSL (thining out clusters while conserving stochiometry of labelling); kolokalizační analýza

4) Fluorescenční korelační kroskorelační spektroskopie (FCS a FCCS) I: teorie FCS: autokorelační a kroskorelační funkce; translační difúze v FCS; inter-system crossing v FCS;

5) FCS a FCCS II: FCS ve dvou dimenzích: aplikace na membrány; FLCS technika; praktické aplikace FCS: reakční kinetika, vázání proteinů na membránu, klastrování proteinů na membráně;

6) PCH – photon counting histogram: principy a aplikace v biofizice; shot noise; Number and brightness metoda (N&B); fluorescence antibunching;

7) Depolarizace fluorescence: definice anisotropie; metody její detekce; excitační a emisní anisotropická spektra; důvody depolarizace fluorescence; kinetika vyhasínání anisotropie; efekty rotační difúze na fluorescenční anisotropii;

8) Försterův přenos energie (hetero-FRET): FRET v rámci jednoho donor-akceptorového páru; migrace enegie mezi dvěma donory (homo-FRET); kinetika vyhasínání fluorescence a anisotropie; single molecule FRET

9) Försterův přenos a migrace energie v poli mnoha donorů a akceptorů:  kinetika vyhasínání fluorescence v poli mnoha akceptorů, FRET na lipidové dvojvrstvě, určení šířky lipidové dvojvrstvy; MC-FRET; detekce lipidových nanodomén; oligomerizace proteinů na membráně – kvantifikace pomocí homo- a hetero-FRETu 

10) Raster Image Correlation Spectroscopy (RICS) a Imaging-FCS: Principy a praktické aplikace

 
Univerzita Karlova | Informační systém UK