Poslední úprava: Mgr. Tomáš Fér, Ph.D. (01.03.2021)
Praktické cvičení zahrnuje práci v laboratoři (část A), interpretaci dat ze sekvenátoru a příprava datových matic (část B), vyhodnocování dat (část C) a základní praktikum analýzy next-generation sequencing (NGS) dat (část D).
A: laboratorní práce - 2 dny
A1. sekvenování DNA
- příprava a odladění PCR amplifikace požadovaného úseku DNA (nekódující úseky cpDNA, ITS…)
- otestování úspěšnosti amplifikace elektroforézou na agarosovém gelu
- přečištění PCR fragmentu pomocí kitu
- kvantifikace PCR produktu (změření koncentrace na spektrofotometru)
- vlastní sekvenační reakce (cycle sequencing) pomocí kitu ABI PRISM BigDye Terminator v3.1
- přečištění produktu, příprava pro analýzu na sekvenátoru
- použití automatického sekvenátoru ABI 3130xl Avant na biologické sekci PřF UK
A2. mikrosatelity
- použití specifických primerů pro jaderné mikrosatelity (PCR reakce)
- použití univerzálních pro chloroplastové mikrosatelity (PCR reakce)
- otestování úspěšnosti amplifikace elektroforézou na agarosovém gelu
- precipitace PCR produktů, příprava pro analýzu na sekvenátoru
- fragmentační analýza na sekvenátoru ABI 3100xl Avant na biologické sekci PřF UK
A3. základy přípravy NGS knihoven
- fragmentace DNA pomocí Covaris M220
B: interpretace dat ze sekvenátoru - 1 den
B1. sekvenování
- editace sekvenčních dat (FinchTV aj.) ze sekvenátoru, příprava pro alignment
- automatický alignment v programu ClustalX a MAFFT
- úprava alignmentu, manipulace se sekvencemi – BioEdit, FaBox
B3. mikrosatelity
- jednoduchá analýza získaných dat v programu GeneMarker
- vysvětlení problému se stutter bands, -A addition ad., příprava datové matice pro další analýzy
C: analýza datových matic - 1 den
C1. sekvenování
- vyhledávání podobných sekvencí v GenBank (BLAST)
- základní tvorby stromů (FastTree)
- kodování indelů – SeqState
- statistické parsimonické sítě - TCS
- příprava datové matice pro další analýzy (NEXUS, PHYLIP formát ad.), konverze mezi formáty
C2. mikrosatelity
- základní analýza dat (MicroSatelliteAnalyser)
- AMOVA (Arlequin)...
D: základní analýza NGS data - 1 den
- získávání FASTQ dat ze short read archive (fastq-dump)
- analýza a hodnocení kvality (FastQC), trimming (Trimmomatic), odstranění duplikátů (fastuniq)
- mapování readů na referenci (BWA)
- analýzy namapovaných readů (samtools, Tablet)
- de-novo assembly chloroplastového genomu (Velvet)
- automatická anotace (web GeSeq)
Předmět je vyučován v rámci projektu CZ.02.2.69/0.0/0.0/18_056/0013322 s názvem ESF pro VŠ II na UK.
Poslední úprava: Mgr. Tomáš Fér, Ph.D. (01.03.2021)
The practical course includes lab work (part A), interpretation of the sequencer data and preparing data matrices (part B), data analysis (part C), and basics of next-generation (NGS) data analysis (part D).
A: lab work - 2 days
A1. DNA sequencing
- PCR amplification of the target DNA region (non-coding cpDNA region, ITS…)
- agarose gel electrophoresis (test of successful PCR amplification)
- cleaning of PCR fragments using the kit
- PCR product quantification (spectrophotometrically)
- cycle sequencing using ABI PRISM BigDye Terminator v3.1 kit
- product precipitation
- sequencing run at ABI 3100xl Avant (Biological section of the Faculty of Science)
A2. microsatellites
- use of specific nuclear primers (PCR reaction)
- use of universal chloroplast primers (PCR reaction)
- agarose gel electrophoresis (test of successful PCR amplification)
- PCR product precipitation, mixing with ROX internal standard
- fragment analysis run at ABI 3100xl Avant (Biological section of the Faculty of Science)
A3. basics of NGS library preparation
- DNA fragmentation using Covaris M220
B: sequencer data interpretation - 1 day
B1. DNA sequencing
- editing of sequences (FinchTV etc.)
- automatic alignment using ClustalX and MAFFT
- alignment editing, manipulation with sequences - BioEdit, FaBox
B2. microsatellites
- data analysis in GeneMarker
- interpreting stutter bands, -A addition etc., the building of data matrices
C: data analysis - 1 day
C1. DNA sequencing
- searching for similar sequences in GenBank (BLAST)
- basic tree building (FastTree)
- indel coding – SeqState
- statistic parsimony network - TCS
- building data matrices for subsequent analyses (NEXUS, PHYLIP format etc.), format conversion
C2. microsatellites
- basic data analyses (MicroSatelliteAnalyser)
- AMOVA (Arlequin)...
D: basic NGS data analysis - 1 day
- FASTQ sequences retrieval from short read archive (fastq-dump)
- data quality evaluation (FastQC), trimming (Trimmomatic), duplicate removal (fastuniq)
- read mapping to the reference (BWA)
- analysis of mapped reads (samtools, Tablet)
- de-novo assembly of chloroplast genome (Velvet)
- automated annotation (web GeSeq)
The course is established within the project CZ.02.2.69/0.0/0.0/18_056/0013322 with the name ‘ESF pro VŠ II na UK‘. |