Last update: doc. RNDr. Iva Zusková, CSc. (23.05.2019)
Single molecule fluorescence spectroscopy has recently experienced unprecedented rapid development
and has become one of the indispensable methods in biophysics. The aim of this course is to make
students familiar with this field. Emphasis is placed on understanding the physico-chemical principles on
which these methods are based. The usefulness of these fluorescence techniques is demonstrated on many
practical examples from the field of biophysics.
Last update: doc. RNDr. Iva Zusková, CSc. (23.05.2019)
Fluorescenční spektroskopie založená na detekci jednotlivých molekul (single molecule fluorescence
spectroscopy) zažila v nedávné době nebývale rychlý rozvoj a stala se tak jednou z nepostradatelných
metod v oblasti biofyziky. Cílem tohoto kurzu je teoreticky seznámit posluchače s tímto oborem. Důraz je
kladen především na porozumění fyzikálně-chemických principů, na nichž jsou tyto metody založeny.
Užitečnost těchto fluorescenčních technik je demonstrována na mnoha praktických příkladech z oblasti
biofyziky.
Literature -
Last update: doc. RNDr. Radek Šachl, Ph.D. (24.05.2019)
1. J. R. Lakowicz, Principles of fluorescence spectroscopy, Springer, 3rd edn., 2006.
2. B. Valeur, Molecular Fluorescence Principles and Applications, Wiley-VCH Verlag GmbH, New York, 2001.
Last update: doc. RNDr. Iva Zusková, CSc. (23.05.2019)
Doporučená literatura 1. J. R. Lakowicz, Principles of fluorescence spectroscopy, Springer, 3rd edn., 2006. 2. B. Valeur, Molecular Fluorescence Principles and Applications, Wiley-VCH Verlag GmbH, New York, 2001.
Requirements to the exam -
Last update: doc. RNDr. Iva Zusková, CSc. (23.05.2019)
Oral exam covering the sylabus
Last update: doc. RNDr. Iva Zusková, CSc. (23.05.2019)
Ústní zkouška v rozsahu přednášené látky
Syllabus -
Last update: doc. RNDr. Iva Zusková, CSc. (23.05.2019)
1) Introduction into fluorescence: Jablonski diagram; absorption and emission spectra; fluorescent probes; kinetics of fluorescence deexcitation; fluorescence decay; average fluorescence lifetime; quantum yield of fluorescence; fluorescence quenching; 2) Detection of individual molecules: principal differences between a classical fluorescence measurements from a large ensemble of molecules and a single molecule fluorescence measurement; photophysics of individual molecules; methods of fluorescence detection; confocal versus wide-filed microscope; total internal reflection fluorescence (TIRF); detection of different protein configurations by sm-FRET; rotations and reorientations of individual molecules;
3) Single particle tracking (SPT): diffusion in two dimensions; random walk; MSD diagrams; different modes of diffusion: free, hindered and hop-diffusion. Methods of SPT measurement; Derived Techniques: brightness analysis and TOCCSL (thinning out clusters while conserving stoichiometry of labeling); colocalization analysis 4) Fluorescence correlation and cross-correlation spectroscopy (FCS and FCCS) I: theory of FCS: autocorrelation and cross-correlation functions; translational diffusion in FCS; inter-system crossing in FCS; 5) FCS and FCCS II: FCS in two dimensions: applications to lipid membranes; FLCS technique; practical applications of FCS: reaction kinetics, protein binding to the membrane, clustering of proteins on the membrane; 6) PCH - photon counting histogram: principles and applications in biophysics; shot noise; Number and brightness method (N&B); fluorescence anti-bunching; 7) Fluorescence depolarization: definition of anisotropy; measurement of anisotropy; excitation and emission anisotropic spectra; causes of fluorescence depolarization; kinetics of fluorescence depolarization; rotational diffusion and its impact on fluorescent anisotropy; 8) Förster resonance energy transfer (hetero-FRET): FRET within one donor-acceptor pair; migration of energy between two donors (homo-FRET); kinetics of fluorescence deexcitation and depolarization; single molecule FRET 9) Förster resonance energy transfer and migration in the field of many donors and acceptors: fluorescence deexcitation kinetics in the field of many acceptors, FRET on lipid bilayer, determination of the thickness of a lipid bilayer; MC-FRET; detection of lipid nanodomains; oligomerization of proteins on the membrane - quantification using homo- and hetero-FRET 10) Raster Image Correlation Spectroscopy (RICS) and Imaging-FCS: Principles and practical applications
Last update: doc. RNDr. Iva Zusková, CSc. (23.05.2019)
1) Úvod do fluorescence: Jablonskiho diagram; absorpční a emisní spektra; fluorescenční značky; kinetika vyhasínání; fluorescenční decay; průměrná doba života; kvantový výtěžek fluorescence; zhášení fluorescence; 2) Detekce jednotlivých molekul: principiální rozdíly vůči klasickému měření fluorescence ze souboru mnoha molekul; fotofyzika jednotlivých molekul; metody detekce fluorescence; konfokální versus
wide-filed mikroskop; metoda TIRF (total internal reflection fluorescence); detekce různých proteinových konfigurací pomocí sm-FRET techniky; rotace a reorientace jednotlivých molekul; 3) Stopování jednotlivých molekul (Single particle tracking, SPT): difúze ve dvou rozměrech; náhodná procházka; MSD diagramy; různé módy difúze: volná, ‚hindered‘ a hop-difúze. Metody měření SPT; odvozené techniky: analýza svítivosti a TOCCSL (thining out clusters while conserving stochiometry of labelling); kolokalizační analýza 4) Fluorescenční korelační kroskorelační spektroskopie (FCS a FCCS) I: teorie FCS: autokorelační a kroskorelační funkce; translační difúze v FCS; inter-system crossing v FCS; 5) FCS a FCCS II: FCS ve dvou dimenzích: aplikace na membrány; FLCS technika; praktické aplikace FCS: reakční kinetika, vázání proteinů na membránu, klastrování proteinů na membráně; 6) PCH – photon counting histogram: principy a aplikace v biofizice; shot noise; Number and brightness metoda (N&B); fluorescence antibunching; 7) Depolarizace fluorescence: definice anisotropie; metody její detekce; excitační a emisní anisotropická spektra; důvody depolarizace fluorescence; kinetika vyhasínání anisotropie; efekty rotační difúze na fluorescenční anisotropii; 8) Försterův přenos energie (hetero-FRET): FRET v rámci jednoho donor-akceptorového páru; migrace enegie mezi dvěma donory (homo-FRET); kinetika vyhasínání fluorescence a anisotropie; single molecule FRET 9) Försterův přenos a migrace energie v poli mnoha donorů a akceptorů: kinetika vyhasínání fluorescence v poli mnoha akceptorů, FRET na lipidové dvojvrstvě, určení šířky lipidové dvojvrstvy; MC-FRET; detekce lipidových nanodomén; oligomerizace proteinů na membráně – kvantifikace pomocí homo- a hetero-FRETu 10) Raster Image Correlation Spectroscopy (RICS) a Imaging-FCS: Principy a praktické aplikace
