Last update: RNDr. Karel Drbal, Ph.D. (31.08.2023)
You will be guided through the basic classification of cytometric methods in their historical context. Technological advantages and disadvantages of individual branches of cytometry will be documented using applications from various fields of science: botany, microbiology, protistology, hydrobiology, molecular biology, genetics, immunology and biomedicine in general.
Practical training is an integral part of this course and it is organized in 4 modules (3 hours each):
- Basic data analysis
- Experiment design
- Sample preparation and measurement of multi-parametric data
- Reporting and advanced data analysis
Applications of cytometry cover wide range of experimental approaches: analysis and sorting of particles of different sizes from sub-micron (chromosomes, bacteria, organelles, vesicles, exosomes) through cells (up to hundreds of micrometers) up to whole organisms of 1mm size. Analysis is not limited to static single parameter - univariate tests, but the main power of cytometry lies in multi-parametric analysis of heterogeneous samples and their functional properties. The introduction of new fluorochromes, including variants of fluorescent proteins, allows us to study functional processes in single living cells down to single protein-protein interactions. Therefore, cytometry is an essential building block of systems biology able to measure dozens of parameters in millions of cells at once.
Cytometry instruments as well as cytometry data are highly complex, fully standardized, and allow the use of robust statistical methods for the analysis. The course contains practical demonstration and detailed exercise in data analysis as well. The main emphasis is put on flow cytometry. Other variants, including mass or image cytometry, are covered theoretically but are not part of the practical exercise.
After completing the course you will have:
- Knowledge of principles of cytometry
- Knowledge of cytometry instrumentation and the use of fluorochromes and probes
- Knowledge of current applications in cytometry in the wide range of scientific fields
- Ability to assess the suitability of selected method in solving a specific problem or a question
- Ability to analyze and interpret results generated by flow cytometry
- Ability to critically assess the quality of cytometry data in the scientific publications
Last update: RNDr. Karel Drbal, Ph.D. (31.08.2023)
Student bude provedený základní klasifikací cytometrických metod s jejich historickým kontextem. Technologické výhody a nevýhody jednotlivých vývojových směrů cytometrie budou dokumentované na aplikacích ve více oborech: imunologii, reprodukční biologii, botanice, mikrobiologii, protistologii, hydrobiologii, molekulární biologii, genetice a biomedicíně obecně.
Součástí je i práce s daty a praktická cvičení ve 4 tematických celcích (á 3 hodiny):
- analýza dat (základní)
- návrh experimentu
- příprava vzorku a měření multiparametrických dat
- reportování a analýza dat (pokročilá)
Aplikační využití cytometrie zahrnuje široké vědecké postupy a experimenty: analýzu a třídění různých velikostí částic od submikronových (chromozomů, bakterií, organel a vesiklů) přes buňky do velikosti stovek mikronů, ale i celých organismů až do velikosti 1mm. Analýza se neomezuje pouze na statické jednoparametrické "screeningové" experimenty, ale hlavní síla cytometrie je v multiparametrické analýze heterogenních vzorků a jejich funkčních vlastností. S objevem nových fluorochromů, včetně různých variant fluorescenčních proteinů, dnes můžeme studovat funkční projevy buněk až na úrovni protein-protein interakcí. Proto se stala cytometrie jedním ze stavebních bloků systémové biologie a umožňuje nám měřit desítky parametrů na miliónech buněk současně.
Technologie cytometrie i vlastní cytometrická data jsou velmi komplexní, plně standardizovaná a umožňují nám použití robustních statistických metod pro jejich analýzu. Součástí předmětu je proto praktická ukázka a detailní procvičení analýzy dat. Důraz je kladený hlavně na klasickou fluorescenční průtokovou cytometrii. Další varianty cytometrie, včetně hmotnostní a obrazové, budou probírané, ale nebudou předmětem vlastních praktických cvičení.
Absolventi budou mít po složení zápočtu a zkoušky:
- znalost principů jednotlivých směrů cytometrie
- znalost o funkci přístrojů a souvisejícím využití vhodných fluorochromů a prób
- znalost o stávajících aplikacích průtokové cytometrie v širokém spektru vědních oborů
- schopnost posoudit vhodnost zvolené metody při řešení konkrétního problému
- schopnost analyzovat a interpretovat výsledky získané průtokovou cytometrií
- schopnost kriticky hodnotit kvalitu cytometrických dat ve vědeckých publikacích
Literature -
Last update: RNDr. Karel Drbal, Ph.D. (31.08.2023)
Beginners: GIVAN, Alice. L.: Flow Cytometry: First Principles, Wiley-Liss, New York, 2001, ISBN-13: 978-0471382249 ORMEROD, Michael. G.: Flow Cytometry - A Basic Introduction, http://flowbook.denovosoftware.com/
Intermediate: DARZYNKIEWICZ, Zbygniew et al.: Methods In Cell Biology, Vol. 103: Recent Advances in Cytometry, Part A, Academic Press, Amsterdam, 2011. DOLEŽEL, Jaroslav et al.: Flow Cytometry with Plant Cells. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, 2007, ISBN-13: 978-3527314874
Protocols, webinars: ROBINSON, J. Paul. et al.: Current Protocols in Cytometry, John Wiley & Sons, New York, 2003, ISBN-13: 978-0471142959
An additional information about selected education videos and MOOC courses will be provided during the course.
Last update: RNDr. Karel Drbal, Ph.D. (31.08.2023)
Pro začátečníky: GIVAN, Alice. L.: Flow Cytometry: First Principles, Wiley-Liss, New York, 2001, ISBN-13: 978-0471382249 ORMEROD, Michael. G.: Flow Cytometry - A Basic Introduction, http://flowbook.denovosoftware.com/
Pro středně pokročilé: DARZYNKIEWICZ, Zbygniew et al.: Methods In Cell Biology, Vol. 103: Recent Advances in Cytometry, Part A, Academic Press, Amsterdam, 2011. DOLEŽEL, Jaroslav et al.: Flow Cytometry with Plant Cells. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, 2007, ISBN-13: 978-3527314874
Metodické učebnice a návody: ROBINSON, J. Paul. et al.: Current Protocols in Cytometry, John Wiley & Sons, New York, 2003, ISBN-13: 978-0471142959
Requirements to the exam -
Last update: RNDr. Karel Drbal, Ph.D. (31.08.2023)
The course itself and the examination is running in-person. A study material and additional information is available in LMS Moodle.
The course credit requirement: - three homework tests during the course is done in Moodle. The limit is 50% points in total - this is the first requirement. - a final multiple choice test during the examination day is done in Moodle. At least 50% point limit is the second requirement for the exam entry.
The three exam parts consist of:
1/ A Report of a common experiment run in the 3rd practical lesson - evaluation of the correct design, conducting the measurement and data analysis. Submit a document in the format of a project report to Moodle by the end of May (a week before the exam) = 45 points. 2/ Your Experimental design for your real or a fictive project - use an example from the literature, introduction to the broad scientific picture incl. citations, a correct selection of fluorochromes/probes incl. your cytometer choice and spectral analysis, justification of the method of data collection and analysis and a description of the expected results - a short project style - max. 4 A4 pages, 45 points. 3/ An optional Wikipedia entry (5000 bytes) in English on the topic in line with Cytometry, including 3-5 matching citations = max. 10 points / login to Wikipedia under your account which I can recognize and enroll in Wikipedia: https://outreachdashboard.wmflabs.org/.
The exam consists of three documents submitted until a week before the final exam = in this case you reach 100% points. There is a 2% progressive penalty for each day of delay from the previous day until the term of presentation during the last week in May/first week in June - to be discussed with all students. According to the evaluation by the tutor, you are going to correct your work in a presentation within the last few days. All students will present their work in 10 minutes presentation of part 1 and 2 in front of all other students in-person. After each presentation, all students will discuss and evaluate each other. Yet, the final decision is up to the tutor, who is going to justify your grades based on your ranking and all other parts of the exam as well. Tutor's decision will be submitted in a written form in Moodle.
A good example of Report and Experimental design will be provided.
Classification: each part of the exam is evaluated separately, and the grading complies with Charles University rules:
100-94 points = A (excellent - summa cum laude) = 1 93-80 = B (very good - insigni cum laude); in Czech classification system = 1 79-60 points = C (good - magna cum laude); in Czech classification system = 2 59-47 points = D (quite good - cum laude); in Czech classification system = 3 46-40 = E (pass - rite); in Czech classification system = 3 below 39 = FX, F (fail); in Czech classification system = 4
In case of a borderline result (77 - 79, 57 - 59, 37 - 39) there is an oral examination done immediately during the presentation day.
Last update: RNDr. Karel Drbal, Ph.D. (31.08.2023)
Výuka a zkoušení probíhá prezenčně. Materiály a další informace jsou dostupné prostřednictvím LMS systému Moodle.
Zápočet se skládá z: - absolvování tří domácích testů v průběhu kurzu, které proběhnou v Moodlu. Musíte získat alespoň 50% bodů v součtu. - závěrečného prakticky orientovaného testu během přednáškového dne. Jedná se o krátký "multiple choice" test na Moodlu. Absolvování tohoto závěrečného testu alespoň na 50% je podmínkou pro připuštění k vlastní zkoušce.
Tři části zkoušky se skládají z:
1/ Reportuspolečně zadaného reálného experimentu = posouzení správnosti jeho návrhu, provedení vlastního měření a analýzy dat. Vlastní experiment provedeme během praktického kurzu č.3. Odevzdáte na Moodle dokument ve formátu projektového reportu s komentářem, co se Vám podařilo a co nikoli. Max. 45 bodů. 2/ Návrhu Vašeho vlastního experimentu pro skutečně Vámi plánovaný nebo fiktivní projekt na základě Vámi zvoleného tématu, které Vas zajímá. Použijete vzor z literatury - uvedení do problematiky včetně citací, správný výběr cytometru a fluorochromů/prób včetně spektrální analýzy, odůvodnění metod měření a metod analýzy dat a popis očekávaných výsledků - styl krátkého projektu - do 4 A4 stránek = max. 45 bodů. 3/ volitelného hesla pro Wikipedii na cytometrické téma (alespoň 5000 bytů) v češtině nebo angličtině, včetně 3-5 souvisejících a obecných citací = max. 10 bodů / nutné zalogování do Wikipedie pod Vaším účtem, který si zaregistrujete v nástěnce Wikipedie na https://outreachdashboard.wmflabs.org/.
Vlastní zkouška se skládá z odevzdání dokumentů (Report a Návrh experimentu) na Moodle (týden před zkouškou), kdy můžete získat 100% možných bodů. Za každý další den prodlení se odečítá 2% z předchozího dne progresivně až do termínu Vaší prezentace během prvního až druhého únorového týdne. Na jednom termínu zkoušky se musí shodnout všichni studenti. Na základě hodnocení a poznámek lektora upravíte během týdne Vaši prezentaci. Budete prezentovat svoje výsledky formou 10-minutové prezentace Reportu a Návrhu experimentu před ostatními studenty, kteří vás též budou hodnotit a také s Vámi diskutovat. Finální známku nicméně určuje lektor s přihlédnutím k vašemu hodnocení, dalším částem zkoušky a svoje rozhodnutí všem písemně zdůvodní.
Vzorové provedení Reportu a Návrhu experimentu bude poskytnuté v rámci výuky.
Klasifikace: každá část zkoušky je hodnocená separátně a celková známka je stanovená podle UK pravidel (stupnice 1-4):
100-94 bodů = A (excelentní - summa cum laude); v UK systému = 1 93-80 bodů = B (výborně - insigni cum laude); v UK systému = 1 79-60 bodů = C (velmi dobře - magna cum laude); v UK systému = 2 59-47 bodů = D (dobře - cum laude); v UK systému = 3 46-40 bodů = E (prospěl/a - rite); v UK systému = 3
U hraničních výsledků (77 - 79, 57 - 59, 37 - 39) bude provedeno dodatečné ústní přezkoušení ihned během zkušebního dne.
Syllabus -
Last update: RNDr. Karel Drbal, Ph.D. (31.08.2023)
The Cytometry course is running in 4 subsequent cycles, each containing 3 lectures in two lecture hours (1,5 hours) and one 3-hour practical training which immediately follows the last lecture in each cycle the same day.
1. cycle: Cytometry basics LECTURES: 1. Basics of cytometry - technology, terminology and history. Classification of cytometry techniques - diverse methods of particle detection up to the cytomics (fluorescent, mass, image, -omics combinations). History, parameters measured by flow cytometry, main parts of flow cytometer - fluidics, laminar flow, flow cell, hydrodynamic focusing, principles of sorting. Electronics and optics of cytometers - light sources, mercury lamps and lasers, optical filters. Detection of light pulses, photodiodes and photomultipliers, parameters of light pulse. Signal amplifiers, digital processing, fluorescence compensation, types of plots for data display. 2. Basic application of flow cytometry Introduction to data analysis - nuclear DNA content, analysis of ploidy, size of nuclear genome, identification of interspecific hybrids, detection of aneuploidy, determination of mode of reproduction, analysis of cell cycle kinetics, apoptosis, analysis of gene expression, study of phytoplankton.
3. PRACTICAL TRAINING: Basics of practical data analysis What you see is what you get: data quality, data standards, data quality, data filtering, resolution and data distribution, transformation, displaying the data - basic plots. Introduction to the open source software for basic analysis (FCSalyzer, opt. Flowing Software), complex software packages (SW: FlowJo, BC Kaluza, BD DiVa).
Course credit test #1
2. cycle: Basic cytometric applications LECTURES: 4. Fluorochrome principles and the use of cytometry in biotechnology and biomedicine: Previous cycle repetition with the focus on standardization and reproducibility of measurement. Small fluorochromes, tandem dyes, FRET, fluorescent proteins, sensors. Selection methods in biotechnology, environmental analysis, connection to the -omics methods.
5. Correlation of the measurement to the data visualization Optics: 3 planes in the flow cell, interrogation point, laser delay, fluorochrome excitation/emission (filters, dichroic mirrors), detectors and signal amplifiers, spectra viewers. Data analysis: light pulse parameters and detection, digital signal processing, compensation of spectral overlap, 1D, 2D, 3D, 4D-kinetics, multiD analysis (incl. dimensionality reduction principles).
Functional tests in cytometry: Apoptosis, proliferation, cell signaling, mitochondria, membrane potential, kinetic tests, rare cells, metabolism. Immunopenotyping of cells and tissues: immune response, tumors, infections, microvesicles, microparticles. Opt. - cytometry methods in virology, microbiology, hydrobiology, protistology and ecology.
6. PRACTICAL TRAINING: Experimental design A design of an experiment (to be done in the 3rd practical lesson) and the limitations of cytometry methods (statistical background - rare cell, autofluorescence, compensation, basics of combinations of fluorochromes, design of antibody panels). Sample preparation theory (solid tissues, bacteria, yeast, viruses, biosafety regulations)
3. cycle: Details of analysis and data measurement LECTURES: 7. Practical data analysis tutorial (titration/voltration) An example of titrated data analysis followed by the measurement of titrated samples.
8. Working with real data SI calculation based on the data measured last lesson, preparation of a report.
Course credit test #2
9. PRACTICAL TRAINING: Sample preparation and measurement of multiparametric data Preparation of 8-color panel of monoclonal antibodies according to the recommendation of EUROFLOW, labeling of blood samples and measurement on a multi-parametric flow cytometer (8-color FACSVerse plus an additional one having more detectors = LSR-II, CytoFLEX S).
4. cycle: Multiparametric data analysis LECTURES:
10. Basic principles of multiparametric data analysis (FlowJo introduction) Data compensation, visualization, scaling, transformation, normalization. Population identification, FMO controls and controls in general, file concatenation, graphical and statistical output in FlowJo.
11. Data compensation tutorial (FlowJo)
12. PRACTICAL TRAINING: Work with our measured data The use of FlowJo in supervised analysis and R tools for unsupervised analysis, data quality check, a complete process of data evaluation, reporting and general troubleshooting - exam training.
Course credit test #3
Last update: RNDr. Karel Drbal, Ph.D. (31.08.2023)
Předmět Cytometrie je vyučován ve 4 cyklech, kdy v každém z nich je série 3 dvouhodinových přednášek (1,5 hodiny čistého času) vždy zakončená jedním praktickým 3-hodinovým cvičením (2 a 1/4 hodiny čistého času), a to ihned po poslední přednášce v dané sérii.
1. cyklus: Základy cytometrie
PŘEDNÁŠKY:
1. Základy cytometrické technologie - termíny a kus historie Klasifikace cytometrických technik - ruzné druhy detekce jednotlivých částic až po cytomiku (průtoková, hmotnostní, obrazová, -omics kombinace). Historie, parametry měřitelné pomocí průtokové cytometrie, základní části průtokového cytometru. Fluidika, laminární proudění, průtoková komůrka, hydrodynamická fokusace, principy sortingu. Elektronika a optika průtokových cytometrů - zdroje světla, rtuťové výbojky a lasery, optické filtry. Detekce světelných pulzů, fotodiody a fotonásobiče, parametry světelného pulzu. Zesilovače signálu, digitální zpracování signálů, kompenzace fluorescence, typy zobrazení výsledků analýzy.
2. Jednoduché aplikace průtokové cytometrie Úvod do analýzy dat - obsah jaderné DNA, stanovení ploidie, určení velikost jaderného genomu, identifikace mezidruhových hybridů, detekce aneuploidie, určení způsobu reprodukce, analýza kinetiky buněčného cyklu, apoptóza, endoreduplikace, analýza genové exprese, studium fytoplanktonu.
3. PRAKTICKÉ CVIČENÍ: Základy praktické analýzy dat
Představení open source SW pro základní způsob analýzy (FCSalyzer, příp. Flowing Software), komplexní SW balíky (SW: FlowJo, BC Kaluza, BD DiVa) a otevřená platforma R. What you see is what you get: datové standardy, kvalita dat, čištění dat, rozlišení a distribuce dat, škálování, transformace, základní způsoby zobrazování, jedno- a víceparametrická analýza DNA. Zápočtový test #1
2. cyklus: Základní cytometrické aplikace
PŘEDNÁŠKY:
4. Principy fluorochromů a praktické využití cytometrie v biotechnologiích a v biomedicíně Zopakování předchozí praktické části s důrazem na standardizaci a reproducibilitu měření. Malé fluorochromy a fluorescenční proteiny, FRET (fluorescenční přenos energie) - tandemy a biosenzory. Selekční metody producentů v biotechnologiích, environmentální analýza, vazba na -omics metodiky.
5. Opakování, korelace měření a zobrazení dat Opakování optiky: 3 osy v průtokové cele cytometru, laser delay, excitace a emise fluorochromů (emise fotonů a průchod optickými filtry a dichroickými zrcadly), prohlížeče spekter ("spectra viewer"), detektory (fotodiody, fotonásobiče, APD), zesilovače signálu. Analýza dat: parametry a detekce světelných pulzů, digitální zpracování signálu, nutnost kompenzace přesvitu fluorescence, typy zobrazení výsledků analýzy (1D, 2D, 3D, 4D-kinetika, multiD včetně vysvětlení redukce dimenzionality).
6. PRAKTICKÉ CVIČENÍ: Návrh experimentu Návrh experimentu (který provedeme ve 3. praktické hodině) a limity cytometrické metodiky (statistika a pozadí - rare cell, autofluorescence, kompenzace, základy kombinací fluorochromů, návrh panelů protilátek) a teorie vlastní přípravy vzorku (pevné tkáně, bakterie, kvasinky, viry, "biosafety“ regulace)
3. cyklus: Detailní analýza a měření dat
PŘEDNÁŠKY:
7. Návod pro analýzu dat (titrace / voltrace) Ukázka analýzy vzorových titrovaných dat, měření titrovaných vzorků.
8. Práce s reálnými daty Kalkulace SI v FCSalyzeru, příprava reportu
Zápočtový test #2
9. PRAKTICKÉ CVIČENÍ: Příprava vzorku a měření multiparametrických dat Příprava osmibarevného panelu monoklonálních protilátek dle doporučení EUROFLOW, značení a měření vzorku krve na 8-barevném cytometru BDFACSVerse (plus jednom dalším s více detektory = LSR-II, CytoFLEX S).
4. cyklus: Analýza multiparametrických dat
PŘEDNÁŠKY:
10. Základní principy analýzy multiparametrických dat (FlowJo – úvod) Kompenzace dat, vizualizace, škálování, transformace, normalizace. Určení populací, FMO kontroly a kontroly obecně, konkatenace souborů, grafické a statistické výstupy ve FlowJo
11. Nácvik kompenzace dat (FlowJo)
12. PRAKTICKÉ CVIČENÍ: Práce s naměřenými daty Použití komerčního SW (FlowJo) pro supervizovanou analýzu a R nástrojů pro nesupervizovanou analýzu naměřených dat, kontrola kvality naměřených dat, způsob jejich hodnocení, reportování, řešení problémů... příprava ke zkoušce
