Last update: RNDr. Nataša Šebková, Ph.D. (25.02.2022)
I. ČÁST - TRVALÉ PREPARÁTY
Vývojová stadia žáby Drápatky vodní - Xenopus laevis
Cíl: nakreslit, popsat a určit jednotlivá vývojová stadia Xenopus laevis
Předložená stadia:
1. oocyty
2. stadium 2 buněk
3. stadium 4 buněk
4. stadium 8 buněk
5. stadium 16 buněk
6. blastula
7. stadium ocasního pupene
8. pulec
Řezové preparáty
varle - Xenopus laevis
fragment ovaria - Xenopus laevis
varle - myš
ovarium - myš
oplozené oocyty Xenopus laevis - pronukleus (pigmentová stopa spermie)
spermie:
myš
čolek
dešťovka
křeček
drápatka
II. ČÁST - ZRÁNÍ PRASEČÍCH OOCYTŮ A IN VITRO FERTILIZACE
Zrání prasečích oocytů a in vitro fertilizace
Obecný úvod
Oogeneze u savců
Samičí pohlavní buňky u savců procházejí 3 důležitými stádii:
1. Dělení - mitotický vznik oogonií (počet založen před narozením)
2. Růst - syntéza proteinů, různých mRNA a dalších důležitých komponent pro časný embryonální vývoj. Společně s rostoucím oocytem dochází ke vzniku folikulu, který svou tekutinou brání zrání oocytu. Oocyt je většinou zastaven v prometafázi I meiotického dělení. (1. meiotický blok). Jádro se nazývá zárodečný váček (GV - Germinal Vesicle).
3. Zrání - po ovulaci se oocyt uvolní z folikulu, čímž dojde k tzv. znovuzahájení meiozy. To se projeví rozpadem zárodečného váčku (GVBD-Germinal Vesicle Break Down) a posléze uspořádáním chromozómů do metafáze I. Po krátké anafázi I - telofázi I oocyt vyčkává na oplození většinou v metafázi II, kdy je možné pozorovat vyloučené 1. pólové tělísko. Přechody mezi jednotlivými fázemi jsou hlavně řízeny CDK1 (Cdc2) a cyklinem B, které dohromady tvoří MPF (Maturation Promoting Factor). Hladina jeho aktivní formy je nejvyšší v metafázi I a hlavně v metafázi II. V období anafáze I - telofáze I je naopak hladina této formy nejnižší. U savců je oocyt až do oplození většinou zastaven v metafázi II (2. meiotický blok). Po uvolnění z prostředí folikulu dochází GVBD do 6-ti hodin. Metafáze I je pozorovatelná mezi 20 - 24 hodinou. Metafáze II pak mezi 42-48 hodinou od izolace.
Oplození u savců
Spermie v pohlavním traktu samice u savců procházejí procesem kapacitace. Po té jsou schopné oplození. Ke kontaktu spermie a oocytu dochází zhruba v horní třetině vejcovodu. Spermie překoná vrstvy kumulárních buněk a po kontaktu se zónou pellucidou dochází k akrozomální reakci (vylití proteolytických enzymů). Po průniku spermie do oocytu nedochází u savčích oocytů ke klasickému rychlému bloku polyspermie (změna polarity oocytární membrány), který známe od ježovky. Ten nemusí být tolik potřebný vzhledem k relativně malému počtu spermií, které se k oocytu dostanou. Dochází však k vylití tzv. kortikálních granulí z oocytu (ekvivalent pomalého bloku polyspermie) a dlouhodobému zabránění vazby a průniku dalších spermií přes zonu pellucidu. Tento proces proběhne mezi 30-60 minutami po oplození a během této doby dojde i ke změnám na plasmatické membráně, které znemožní průnik spermií do cytoplasmy. Průnikem spermie do oocytu dojde pak k jeho aktivaci oscilacemi Ca2+ iontů a k dokončení meiozi. Vzniká tak postupně samičí prvojádro. Současně hlavička spermie začíná dekondenzovat do podoby samčího prvojádra. U obou prvojader po té dochází k syntéze DNA. U savců, na rozdíl např. od ježovky, nedochází v tomto okamžiku k jejich fúzi ale k oddělené kondenzaci do chromozómů v rámci profáze. Po té jsou samčí a samičí chromozómy promíchány v ekvatoriální rovině a během anafáze a telofáze vznikají dvě pravá somatická jádra.
Praktická část
Úkol pro 1. den
Izolace prasečích oocytů z folikulů aspirační metodou.
Folikuly vaječníku nabodneme injekční stříkačkou s jehlou a odsáváme folikulární tekutinu, která obsahuje volné oocyty obalené vrstvami kumulárních buněk. Uděláme si také foto vaječníku pod stereomikroskopem (obr. I). Po té aspirovanou tekutinu přeneseme do víčka 3 cm Petriho misky.
Pod stereobinolupou skleněnou kapilárou nasáváme jednotlivé oocyty, které přenášíme do druhé 3 cm Petriho misky se 4 kapkami (4 x 50 µl) manipulačního média (M2) pod olejem. Izolované oocyty prohlížíme pod stereobinolupou. Prasečí oocyty jsou tmavé (lipidová granula) a jsou obaleny několika vrstvami kumulárních buněk. Oocyty si následně vyfotíme pod stereomikroskopem do tabla (obr. A). Oocyty spočítáme a rozdělíme do dvou skupin. 1. skupina by měla odpovídat cca 1/3 z celkového počtu vámi vyizolovaných oocytů a je určena pro fixaci po 24 hodinách kultivace (stádium metafáze I). Ve 2. skupině by měly být zbylé 2/3 oocytů a ty necháme kultivovat 42-48 hodin do stádia metafáze II s následným in vitro oplozením kančími spermiemi.
1. skupinu oocytů přeneseme skleněnou kapilárou do 4-jamkové destičky s 500 ml média M199 se 4 mg/ml GPBoS (růstové proteiny bovinního séra) překrytého 500 µl parafinového oleje. 2. skupinu obdobně přeneseme do druhé 4-jamkové destičky se stejným médiem. Při přenosu dáváme pozor, abychom oocyty přenesli do média na dně jamky, a nevypustili je do oleje nad médiem. Jamky s oocyty si označíme. Poté obě destičky kultivujeme v termostatu při teplotě 38,5 °C a 5% CO2.
Úkol pro 2. den
Fixace 1. skupiny oocytů po 24 hodinové maturaci
Z termostatu vyjmeme 4 jamkovou destičku s oocyty určenými pro fixaci v metafázi (1. skupina oocytů) a rychle vyfotíme pod stereomikroskopem (obr. B). Do každé z jamek napipetujeme á 25 ml 0,1% hyázy (Hyaluridonáza) a zamícháme. Tento enzym rozvolní expandovaný kumulus a umožní odstranění jeho buněk. Asi po 3-5 minutách oocyty přeneseme do kapky manipulačního média (M2) v 3 cm Petriho misce a odstraníme zbylé kumulární buňky protahováním tenkou skleněnou kapilárou. Po očištění si všímáme poměrně silné zóny pellucidy, která je dobře patrná při polovičním zástinu. Oocyty poté přeneseme do 500 µl 4% roztoku formaldehydu v PBS, který budete mít ve 4-jamkové destičce, a zde je fixujeme do dalšího dne při 4 °C.
Úkoly pro 3. den
1. In vitro fertilizace
Spermie určené pro in vitro fertilizaci označíme vitálním barvením jádra a mitochondrií (Hoechst 33258 + Mitotracker Red CMX Ros) následujícím způsobem.
Odpipetujeme 3 ml spermií do 10 ml zkumavky s modrým uzávěrem. Zkumavku centrifugujeme při 700G (2.650 ot/min – centrifuga MPW-340) po dobu 5 minut. Pasteurovou pipetou odebereme supernatant a přidáme 7 ml sterilního PBS + 0,01% PVA (polyvinylalkohol) z lahvičky. Vše důkladně zamícháme a centrifugujeme 5 minut při 700 G. Tento krok opakujeme ještě jednou. Na závěr odsajeme supernatant a spermie velmi důkladně resuspendujeme ve 2 ml PBS + 0,01% PVA. Z této suspenze si co nejdříve přeneseme 500 µl do 1,5 ml ependorfky a přidáme 5 µl Mitotrackeru (1 mM roztok v DMSO) a 2 µl Hoechst 33258 (1 mg/ml). Důkladně zamícháme a necháme inkubovat při 17 °C. Tyto spermie budeme po používat na umělé oplození (po alespoň 30 minutách inkubace) a pro pozorování samotných spermií (po 1-2 hodinách inkubace).
Do další 1,5 ml ependorfky napipetujeme 990 µl destilované vody. Z původní suspenze ve zkumavce odebereme 10 µl, které přidáme do ependorfky s vodou a důkladně promícháme (spermie jsou nyní 100 x ředěné a jsou znehybněné). Takto vzniklá suspenze je určená pro počítání spermií. Zbytek původní suspenze odložíme do boxu s teplotou 17 °C.
Zjištění koncentrace spermií na mililitr provedeme následujícím způsobem. Ze 100x ředěné suspenze (v ependorfce s vodou) odebereme 10 µl a aplikujeme je mezi krycí a podložní sklo Burkerovy komůrky. Komůrku umístíme do mikroskopu a spočítáme spermie, které se nacházejí v 16 velkých čtvercových polích (oblast je ohraničena trojitou rýhou). Nepočítáme ty spermie, které leží mezi velkými čtverci. Postup opakujeme ještě 3 x, vždy na jiných místech Burkerovy komůrky. Výsledné čtyři hodnoty zprůměrujeme. Koncentraci spermií na ml vypočteme podle následujícího vzorečku:
X = (průměrný počet spermií v 16 velkých polích) x 15 625 x 100
Vysvětlení výpočtu:
Plocha jednoho velkého čtverce = 0,04 mm2 , hloubka komůrky = 0,1 mm
Objem tekutiny nad jedním velkým čtvercem = 0,04 x 0,1 = 0,004 mm3 (µl)
Objem tekutiny nad 16 velkými čtverci = 0,004 x 16 = 0,064 mm3 (µl)
Přepočet na 1 cm3 (ml) = 1000 / 0,064 = 15 625 (koeficient ve vzorečku)
Suspenzi jsme 100 x ředili. Proto je nutné výslednou hodnotu vynásobit.
Zatímco část skupiny počítá spermie, zbylí členové si vyndají 4-jamkovou destičku s oocyty maturovanými do metafáze 2, vyfotí je (obr. C) a očistí tyto oocyty maturované 42-48 hodin od kumulárních buněk stejným způsobem jako v případě oocytů určených pro fixaci po 24 hodinách zrání. Očištěné oocyty dále pozorujeme pod stereobinolupou a pokoušíme se nalézt 1. pólové tělísko, které se nachází pod zónou pellucidou jako kulovitý útvar, oocyt s viditelným pólovým tělískem vyfotíme (obr. F). Přítomnost pólového tělíska značí, že oocyt je maturovaný a zastavený v metafázi II. Oocyty si rozdělíme na dvě poloviční skupiny. Přičemž 1. skupina se bude fixovat 1-2 hodiny v 500 µl 4% roztoku formaldehydu v PBS, který budete mít ve 4-jamkové destičce (stejně jako oocyty v metafázi 1) při pokojové teplotě. 2. skupinu použijeme na umělé oplození.
Máme již připravené vitálně značené spermie, v ependorfce v 17 °C. Každá skupina bude mít k dispozici pro oplození jednu jamku s 500 µl média mTBM se 2 mg BSA/ml (IVF médium). Ze suspenze značených spermií odebereme tolik µl aby po naředění do 500 µl mTBM média byla výsledná koncentrace 500.000 spermií/ml. Vše opatrně zamícháme a do jamky se spermiemi přidáme 2. skupinu očištěných oocytů. Vše necháme inkubovat 1-2 hodiny v termostatu při teplotě 38,5 °C, 5% CO2. Poté pozorujeme kontakt obou gamet pod stereobinolupou a následně pod fluorescenčním mikroskopem (obr. H). Přípravu preparátu provedeme stejným způsobem jako v případě pozorování fluorescenčně značených oocytů ve stádiu MI a MII (viz níže, bod 2).
Pro pozorování vitálně barvených spermií si připravíme očištěné podložní a krycí sklo. Spermie inkubované v ependorfce při 17 °C naředíme 1:1 s roztokem 4% formaldehydu v PBS. To provedeme tak, že do nové ependorfky si napipetujeme 500 µl 4% roztoku formaldehydu a přidáme 500 µl značených spermií. Na podložní sklo naneseme 20 µl výsledné suspenze spermií a přiklopíme krycím sklem. Preparát orámujeme lakem na nehty a po důkladném zaschnutí pozorujeme pod fluorescenčním mikroskopem. Hlavičky spermií jsou obarveny modře (Hoechst 33258), krček a část mid-piece je značen červeně (Mitotracker). Spojením fotografií z jednotlivých fluorescenčních kanálů a fotografie z fázového kontrastu dostane výslednou fotografii (obr. G).
2. Barvení preparátů fixovaných oocytů po 24 (MI) a 42-46 (MII) hodinách maturace
Vyrobíme si 2 oplachové misky tak, že naneseme na obě poloviny, dno i víčko, 3cm Petriho misky 2 kapky PBS + PVA. Misky si označíme popisem MI a MII. Do první kapky na obou miskách přeneseme oocyty z fixáže ve 4-jamkových destičkách (jedna je z 1. dne=oocyty v MI, druhá z dopoledne=oocyty v MII) a necháme 5 minut inkubovat. Pak přeneseme oocyty do 2. kapky a opět 5 minut inkubujeme.
Připravíme si stejným způsobem 2 podložní skla, označíme si je MI a MII. Z etanolové lázně vyjmeme podložní skla, osušíme a vyleštíme, dále si vyleštíme skla krycí. Podle velikosti krycího skla naneseme do „budoucích rohů“ trochu vazelíny z připravené injekční stříkačky. Do středu pole vymezeného vazelínou napipetujeme 10 µl montovacího media s DAPI. Do kapky tohoto média přeneseme opláchnuté oocyty a necháme cca 2 minuty promísit. Opatrně přiložíme očištěné krycí sklo a pinzetou jemně tlačíme na jeho rohy (v místech, kde se nachází vazelína). Přitlačujeme zhruba do doby, než původní kapka manipulačního média zdvojnásobí svůj průměr. (POZOR VŠAK NA PŘÍLIŠNÝ TLAK – OOCYTY SNADNO PRASKAJÍ.) Poté velmi opatrně orámujeme krycí sklo lakem na nehty a necháme zaschnout. Při nanášení laku se snažte zabránit posunutí krycího skla. (Pod fluorescenční mikroskop preparát dávejte až v okamžiku, kdy je lak zcela zaschlý.) Pod mikroskopem se poté snažíme najít chromozomy v metafázi na sklíčku s popisem MI (obr. D) a metafázi s pólovým tělískem na sklu MII (obr. E).
III. ČÁST - EMBRYONÁLNÍ VÝVOJ C. ELEGANS
Háďátko Caenorhabditis elegans
Caenorhabditis elegans patří mezi volně žijící nepatogenní hlístice. V přírodě jej najdeme v půdě, kde se živí bakteriemi. U háďátka rozlišujeme dvě pohlaví - převažující hermafrodity se schopností samooplození (kombinace pohlavních chromozómů XX) a zřídka se vyskytující samce (0.05% populace, kombinace pohlavních chromozómů X0).
V laboratoři je C. elegans významným modelovým organizmem. Na jedné straně je to reprezentant mnohobuněčných eukaryot, na druhé straně má jednoduché průhledné tělo, které umožňuje studovat celou řadu procesů přímo v živém organizmu. Háďátko se také snadno pěstuje v laboratoři a má krátkou generační dobu (3-4 dny). Embryonální vývoj je determinační, s přesně daným počtem buněk, takže je možné sledovat vývoj každé jednotlivé somatické buňky. Dospělý hermafrodit má 959 somatických buněk, zatímco u dospělého samce jich je 1031.
Homeotické geny (Hox) kódují transkripční faktory, jejichž typickou součástí je evolučně konzervovaná DNA vazebná oblast nazývaná homeodoména. Hox geny hrají klíčovou úlohu v určení předozadní osy těla a v rozdělení těla na jednotlivé segmenty. U C. elegans došlo ke ztrátě některých Hox genů, navíc je zde exprese Hox genů více závislá na typu buněk než na konkrétní pozici v rámci těla. I přes tyto změny jsou Hox geny důležité pro určení osudu buněk.
Vaším úkolem je detegovat expresi tří různých Hox genů v C. elegans: mab-5 (ftz, fushi tarazu), lin-39 (Scr, sex combs reduced or Hox5) and egl-5 (Abd-B, abdominal B). Dostanete linie háďátek nesoucí lacZ reporter, jehož exprese je vždy řízena promotorem jednoho z výše zmíněných genů.
• Spláchněte háďátka z petriho misky 800μl pufru M9
• Centrifugujte 1000g/30 sec ~ 3000 rpm / 30 sec., opatrně odsajte supernatant
• Přidejte 800 μl dH2O, centrifugujte, opatrně odsajte supernatant
• Sušte ve speedvacu 20 min.
• Inkubujte ve 300 μl acetonu (na ledu) 2 min. 2x, vždy centrifugujte a odsajte supernatant
• Nechte zbylý aceton vytěkat
• Přidejte 250 μl barvicího roztoku, nechte vyvíjet, chraňte před světlem
• Reakci zastavte přidáním 800 μl pufru M9, centrifugujte a odsajte supernatant
• Zhotovte preparát a pozorujte pod mikroskopem
Barvicí roztok na 1ml
1M NaH2PO4 33 μl
0.5M Na2HPO4 332 μl
0.1M MgCl2 1 μl
0.3M K3Fe(CN)6 16.5 μl
0.3M K4Fe(CN)6 16.5 μl
1%SDS 4 μl
2% X-gal 12.5 μl
100% formamid 3 μl
voda 581.5 μl
Exprese Hox genů v embryu C. elegans:
(Wang et al., 1993)
DAPI barvení
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) je fluorescenční barva vázající se na DNA, takže se využívá k barvení jednotlivých chromozómů i celých jader
Vám toto jednoduché barvení umožní lepší orientaci v morfologii různých vývojových stádií háďátka.
• Spláchněte háďátka z petriho misky 800μl pufru M9
• Centrifugujte 1000g/30 sec ~ 3000 rpm / 30 sec., opatrně odsajte supernatant
• Fixujte 300 μl metanolu (20 min., na ledu)
• Centrifugujte, opatrně odsajte supernatant
• Inkubujte ve 300 μl acetonu (10 min., na ledu)
• Centrifugujte, opatrně odsajte supernatant
• Promyjte 800 μl pufru M9, centrifugujte, opatrně odsajte supernatant
• Zvířata resuspendujte v roztoku DAPI (1 μg/ml), chraňte před světlem!!!
• Promyjte 800 μl pufru M9, centrifugujte, opatrně odsajte supernatant
• Zhotovte preparát a pozorujte pod fluorescenčním mikroskopem
