Genomové manipulace a reverzní genetika
Selekční a reportérové geny, nástroje pro manipulaci s genomem (místně specifické rekombinázy, místně specifické endonukleázy, homologní rekombinace)
reverzní genetika - náhodná inaktivace genu (transpozonová mutageneze, TILLING, genová past), cílená inaktivace genu (knock-out, RNA-interference), regulovaná exprese genu.
Genomové modifikace u modelových organizmů
Charakteristika a specifika modelových organismů molekulární biologie (E. coli, S. cerevisie, D. melanogaster, C. elegans, A. thaliana, myš, člověk - tkáňové kultury), vytváření knock-outů, podmíněných knock-outů, knock-inů, metody transformace, vektory.
Genové modifikace člověka - genová terapie
In vivo a ex vivo genová terapie, kmenové buňky, klonování, indukované pluripotentní buňky, virové vektory pro genovou terapii (retrovirové, adenovirové, AAV), jejich produkce, nevirové vektory (transpozonové), metody transfekce, design polymerních nosičů DNA, přístupy genové terapie (exprese funkční alely genu, exprese sebevražedného genu, snížení exprese genu, oprava poškozeného genu), antisense terapie.
Sekvenace DNA
Chronologický pohled na sekvenační metody (metoda chemické degradace, dideoxy metoda, pyrosekvenování, metody druhé generace (454, Illumina, Ion Torrent),metody třetí generace (PacBio), sekvenace de novo vs. resekvenace, sekvenace exomu, postup sekvenace genomů, genomové projekty.
Metody studia genové exprese
Metody studia exprese jednotlivých genů: EST, Northern blot, qRT-PCR (kinetika PCR, hodnota Ct, sondy pro detekci, normalizace, efektivita PCR).
Metody studia transkriptomu: DNA čipy (princip, prezentace výsledků: teplotní mapy, clusterování; dlaší oblasti použití DNA čipů), sekvenace RNA (RNA-Seq).
Metody studia proteinů
Stanovení koncentrace proteinů, separace: PAGE (denaturační, nativní), barvení, Izolace a purifikace proteinů s využitím afinitních tagů, imunoznačení-protilátky (primární, sekundární, způsoby detekce, výroba), imunoprecipitace,
Western blot, ELISA, metody stanovení protein-proteinových interakcí na úrovni jednotlivých proteinů (pull-down assay, proximity ligation assay) i celého proteomu (koimunoprecipirace, TAP, 2-hybridový systém, komplementační assay, phage display), degron, protein arrays (analytický vs. funkční čip).
Proteomika
hmotnostní spektrometrie: separace, ionizační techniky, typy analyzátorů, tandemová MS.
Fluorescence a fluorescenční značení
Základy fluorescence, filtry a zdroje světla, fluorescenční značení buněk a organel, použití fluorescenčních sond, fluorescenční sondy pro měření vnitrobuněčného pH, koncentrace iontů, membránového potenciálu.
Fluorescenční mikroskop, konfokální mikroskop a dvoufotonový konfokální mikroskop. Zelený fluorescenční protein (GFP) a jeho varianty. Možnosti využití fluorescenční proteinů, FRET, FRAP,FLIM.
Průtoková cytometrie.
průtokový cytometr a buněčný sorter, princip měření, dot plot, gateování populací, mnohobarevná průtoková cytometrie, hmotnostní cytometrie.
Pokročilé mikroskopické techniky
Atomic force microscopy, mikroskopie blízkého pole, TIRM, fluorescenční mikroskopie s vysokým rozlišením (4Pi, STED, PALM/STORM).
Metody budoucnosti
Sekvenace DNA třetí generace (sekvenace nanopórem a další vyvíjené techniky), single-cell techniky (laserová mikropreparace, optická pinzeta, magnetická pinzeta), DNA origami a DNA nanoarray, lab-on-chip - mikrofluidní čipy.
Last update: Čáp Michal, RNDr., Ph.D. (20.03.2017)
