Please note, the lectures are given in Czech language only. Study literature and tutorials can be given in English. Specialized practical course of molecular methods in plant systematics and population biology. Three methods will be demonstrated: AFLP, microsatellites and DNA sequencing. The course includes lab work (3 days) and evaluating the data from sequencer using specialized software (2 days).
Last update: Fér Tomáš, Mgr., Ph.D. (07.10.2019)
Praktická výuka metod sekvenování DNA, AFLP a mikrosatelitů s důrazem na jejich využití v systematice a populační biologii rostlin. Kurz je koncipován formou vědeckého projektu a zahrnuje přípravu projektu, práci v laboratoři, interpretaci dat ze sekvenátoru a přípravu datových matic, vyhodnocování dat a celkové vyhodnocení a prezentaci projektu.
Last update: Fér Tomáš, Mgr., Ph.D. (07.10.2019)
Literature -
Weising K. et al. (2005): DNA fingerprinting in plants. Principles, methods, and applications. 2nd edition.
Caetano-Anollés G. & Gresshoff P.M. (1998): DNA markers. Protocols, applications, and overviews.
Hall B.G. (2001): Phylogenetic trees made easy.
Last update: Fér Tomáš, Mgr., Ph.D. (22.04.2012)
Weising K. et al. (2005): DNA fingerprinting in plants. Principles, methods, and applications. 2nd edition.
Caetano-Anollés G. & Gresshoff P.M. (1998): DNA markers. Protocols, applications, and overviews.
Hall B.G. (2001): Phylogenetic trees made easy.
Last update: Fér Tomáš, Mgr., Ph.D. (22.04.2012)
Requirements to the exam -
write out protocols
Last update: Fér Tomáš, Mgr., Ph.D. (07.10.2019)
Vypracované protokoly k řešeným úkolům podle pokynů přednášejícího.
Last update: Fér Tomáš, Mgr., Ph.D. (07.10.2019)
Syllabus -
Practical course includes lab work (part A), interpretation of the sequencer data and preparing data matrices (part B), and data analysis (part C).
A: lab work
A1. DNA sequencing
PCR amplification of the target DNA region (trnL-trnF or other non-coding cpDNA region, ITS…)
agarose gel electrophoresis (test of successful PCR amplification)
cleaning of PCR fragments using kit
PCR product quantification (photometrically)
cycle sequencing using ABI PRISM BigDye Terminator v3.1 kit
product precipitation
sequencing run at ABI 3100 Avant (Biological section of the Faculty of Science)
A2. AFLP
total DNA restriction using AFLP Core Reagent Kit (Invitrogen)
adaptor ligation
preamplification using AFLP Pre-Amp Primer Mix I (Invitrogen)
selective amplification with fluorescence-labelled primers
PCR product precipitation, mixing with ROX internal standard
fragment analysis run at ABI 3100 Avant (Biological section of the Faculty of Science)
A3. microsatellites
use of specific nuclear primers (PCR reaction)
use of universal chloroplast primers (PCR reaction)
agarose gel electrophoresis (test of successful PCR amplification)
PCR product precipitation, mixing with ROX internal standard
fragment analysis run at ABI 3100 Avant (Biological section of the Faculty of Science)
B: sequencer data interpretation
B1. DNA sequencing
editing of sequences (FinchTV etc.)
automatic alignment using ClustalX
alignmentu editing in BioEdit
building of data matrices
B2. AFLP
data analysis in GeneScan
data evaluation in Genographer, building of data matrices
B3. microsatellites
data analysis in GeneMarker
interpreting stutter bands, -A addition etc., building of data matrices
C: data analysis
C1. DNA sequencing
distance methods (TreeCon)
maximum parsimony, maximum likelihood (PAUP)
Bayesian analysis (MrBayes)
C2. AFLP
tree building (TreeCon)
multidimensional methods (Canoco, SYNTAX)
AMOVA (Arlequin)
missing data handling (FAMD)...
C3. microsatellites
basic data analyses (MicroSatelliteAnalyser)
AMOVA (Arlequin)...
Last update: Fér Tomáš, Mgr., Ph.D. (07.10.2019)
Praktické cvičení zahrnuje přípravu projektu (část A), práci v laboratoři (část B), interpretaci dat ze sekvenátoru a příprava datových matic (část C), vyhodnocování dat (část D) a celkové vyhodnocení a prezentaci projektu (část E). Jednotlivé části na sebe nutně nemusí časově navazovat, předpokládá se i samostatná domácí práce studentů.
A: přípravná fáze (samostatná práce studentů ve skupinách) - 2 dny
seznámení studentů s projektem
vyhledávání dosavadních informací o studované skupině (Web of Science, on-line zdroje PřF UK, knihovna Katedry botaniky…)
formulace otázek, které bude možné řešit pomocí molekulárních metod; zjistit, které molekulární metody bude vhodné použít
zjištění informací o metodice odběru vzorků z živého materiálu a možnostech extrakce DNA (s důrazem na studovanou skupinu)
seznámení se studovanou skupinou (sbírka Botanické zahrady UK)
zhotovení seznamu objektů, které budou molekulárně studovány
prezentace jednotlivých pracovních skupin o zjištěných informacích
sestavení cílů projektu a metodiky
B: laboratorní práce - 4 dny
B1. sekvenování DNA
příprava a odladění PCR amplifikace požadovaného úseku DNA (nekódující úseky cpDNA, ITS…)
otestování úspěšnosti amplifikace elektroforézou na agarosovém gelu
přečištění PCR fragmentu pomocí kitu
kvantifikace PCR produktu (změření koncentrace na fotometru)
vlastní sekvenační reakce (cycle sequencing) pomocí kitu ABI PRISM BigDye Terminator v3.1
přečištění produktu, příprava pro analýzu na sekvenátoru
použití sekvenátoru ABI 3130 Avant na biologické sekci PřF UK
B2. AFLP
restrikce celkové DNA pomocí kitu AFLP Core Reagent Kit (Invitrogen)
ligace adaptorů k restrikčním fragmentům pomocí téhož kitu
preamplifikace pomocí kitu AFLP Pre-Amp Primer Mix I (Invitrogen)
selektivní amplifikace s fluorescenčně značeným primerem
precipitace PCR produktů, příprava pro analýzu na sekvenátoru
fragmentační analýza na sekvenátoru ABI 3100 Avant na biologické sekci PřF UK
B3. mikrosatelity
použití specifických primerů pro jaderné mikrosatelity (PCR reakce)
použití univerzálních pro chloroplastové mikrosatelity (PCR reakce)
otestování úspěšnosti amplifikace elektroforézou na agarosovém gelu
precipitace PCR produktů, příprava pro analýzu na sekvenátoru
fragmentační analýza na sekvenátoru ABI 3100 Avant na biologické sekci PřF UK
C: interpretace dat ze sekvenátoru - 0,5 dne
C1. sekvenování
editace sekvenčních dat (FinchTV aj.) ze sekvenátoru, příprava pro alignment
automatický alignment v programu ClustalX
úprava alignmentu v programu BioEdit
příprava datové matice pro další analýzy (NEXUS formát ad.)
C2. AFLP
analýza získaných dat v programu GeneScan
vyhodnocování AFLP dat v programu Genographer, příprava datové matice pro další analýzy
C3. mikrosatelity
jednoduchá analýza získaných dat v programu GeneMarker
vysvětlení problému se stutter bands, -A addition ad., příprava datové matice pro další analýzy
D: analýza datových matic - 1,5 dne
C1. sekvenování
vyhledávání podobných sekvencí v GenBank (BLAST)
distanční metody (TreeCon, PAUP)
maximální parsimonie, maximum likelihood (PAUP, Modeltest)
Bayesovská analýza (MrBayes)
D2. AFLP
tvorba stromů (TreeCon)
mnohorozměrné analýzy (FAMD)
AMOVA (Arlequin, FAMD)
zacházení s chybějícími daty (FAMD)...
D3. mikrosatelity
základní analýza dat (MicroSatelliteAnalyser)
AMOVA (Arlequin)...
E: celkové vyhodnocení a prezentace projektu - 2 dny
diskuse nad výsledky v souvislosti se znalostmi rozšíření, biologie a ekologie jednotlivých zkoumaných druhů
srovnání výsledků s použitím různých metod, interpretace
srovnání molekulárně-fylogenetických výsledků s morfologií jednotlivých taxonů
příprava prezentace výsledků projektu (tabulky, fylogenetické stromy, mapy rozšíření…)
příprava plakátového sdělení (posteru) o výsledcích projektu - základní pravidla pro tvorbu posterů, jak zaujmout a jasně prezentovat důležité výsledky
prezentace výsledků formou přednášek jednotlivých studentů (minikonference)
