Please note, the lectures are given in Czech language only. Study literature and tutorials can be given in English. Practical introduction to the methods of molecular markers in DNA lab at the Department of Botany. Students will learn methods of DNA extraction from plant material and PCR optimization. In the second part RAPD and PCR-RFLP methods will be demonstrated.
Last update: Fér Tomáš, Mgr., Ph.D. (07.10.2019)
Praktické seznámení s metodami molekulárních markerů v DNA laboratoři Katedry botaniky. Studenti se nejprve naučí extrahovat DNA z rostlinného materiálu a optimalizovat PCR reakci. Ve druhé části si vyzkouší metody RAPD, PCR-RFLP cpDNA.
Last update: Fér Tomáš, Mgr., Ph.D. (07.10.2019)
Literature -
Weising K. et al. (2005): DNA fingerprinting in plants. Principles, methods, and applications. 2nd edition.
Caetano-Anollés G. & Gresshoff P.M. (1998): DNA markers. Protocols, applications, and overviews.
Hall B.G. (2001): Phylogenetic trees made easy.
Last update: Fér Tomáš, Mgr., Ph.D. (22.04.2012)
Weising K. et al. (2005): DNA fingerprinting in plants. Principles, methods, and applications. 2nd edition.
Caetano-Anollés G. & Gresshoff P.M. (1998): DNA markers. Protocols, applications, and overviews.
Hall B.G. (2001): Phylogenetic trees made easy.
Last update: Fér Tomáš, Mgr., Ph.D. (22.04.2012)
Requirements to the exam -
write out protocols
Last update: Fér Tomáš, Mgr., Ph.D. (07.10.2019)
Vypracované protokoly k řešeným úkolům podle pokynů přednášejícího.
Last update: Fér Tomáš, Mgr., Ph.D. (07.10.2019)
Syllabus -
1st day
introduction, methods of study of DNA, differences among molecular markers
DNA extraction from plant material (CTAB method) - fresh and dried material
electrophoresis, making agarose minigels, use of DNA ladders
working with documentation system Kodak Gel Logic 100
determining of DNA concentration using UV photometer, DNA dilution
2nd day
PCR amplification, making PCR premix, methods of PCR optimization
working with termocyclers Techne Touchgene and Mastercycler ep gradient S
making new PCR programs, use of gradient block for PCR optimization
RAPD method
electrophoresis of PCR bands and their visualization
working with the software for gel analysis (KODAK 1D Image Analysis Software) - comparison of RAPD patterns, determination of the lengths of PCR bands
3rd day (PCR-RFLP)
amplification of specific regions of cpDNA using universal primer pairs
PCR optimization using gradient block
electrophoresis - test of successful PCR
PCR amplification using optimal annealing temperature
restriction of PCR bands with restriction endonucleases
4th day
preparing vertical polyacrylamide gels
separation of restriction fragments on the vertical polyacrylamide gel
gel staining - ethidiumbromide or SYBR Green I
visualization of restriction pattern using documentation system Kodak Gel Logic 100
working with the software for gel analysis (KODAK 1D Image Analysis Software) - comparison of PCR-RFLP patterns, determination of the lengths of restriction fragments
5th day
RAPD and PCR-RFLP data analyses, reading of gels
data preparation for further biosystematics a population genetic analyses
phylogenetic and population genetic analyses using specialized software (TreeCon, SYNTAX, PopGen, Arlequin)
Last update: Fér Tomáš, Mgr., Ph.D. (07.10.2019)
1. den
úvod do problematiky, metody studia DNA, rozdíly mezi jednotlivými typy markerů
extrakce DNA z rostlinného materiálu (CTAB metoda) - čerstvý i vysušený materiál
elektroforéza, příprava agarosových minigelů, použití DNA markerů (žebříčků)
práce s dokumentačním systémem Kodak Gel Logic 100
stanovení koncentrace extrahované DNA pomocí UV fotometru, ředění DNA
2. den
PCR amplifikace, příprava směsi pro reakci, metody optimalizace reakčních podmínek
zacházením s termocyclerem Techne Touchgene a Mastercycler ep gradient S
vytváření nových programů, využití gradientového bloku pro optimalizaci PCR reakce
metoda RAPD
elektroforéza získaných PCR produktů a jejich visualizace
práce se softwarem pro analýzu gelů (KODAK 1D Image Analysis Software) - porovnání RAPD pattern, stanovení přibližné délky získaných PCR produktů
3. den (PCR-RFLP)
amplifikace konkrétních úseků cpDNA pomocí universálních primerových párů
optimalizace PCR amplifikace pomocí gradientového bloku
elektroforéza - test úspěšné PCR
PCR amplifikace s použitím optimální teploty annealingu
štěpení získaných PCR produktů několika restrikčními enzymy
4. den
příprava vertikálního polyakrylamidového gelu
rozdělení restrikčních fragmentů podle délky na vertikálním polyakrylamidovém gelu
gel staining - ethidiumbromidu nebo SYBR Green I
visualizace restrikčních fragmentů dokumentačním systémem Kodak Gel Logic 100
práce se softwarem pro analýzu gelů (KODAK 1D Image Analysis Software) - porovnávání restrikčních pattern, stanovení přibližné délky restrikčních fragmentů
5. den
analýza dat z RAPD a PCR-RFLP, čtení gelů
příprava dat pro další biosystematické a populačně-genetické analýzy
fylogenetické analýzy a populačně-genetické analýzy použitím specializovaného software (TreeCon, SYNTAX, PopGen, Arlequin)
