Practical course on proteomics - MB170C112

• Title: Proteomické praktikum
• Czech title: Proteomické praktikum
• Guaranteed by: Department of Zoology (31-170)
• Faculty: Faculty of Science
• Actual: from 2020
• Semester: summer
• E-Credits: 2
• Examination process: summer s.:
• Hours per week, examination: summer s.:0/1, C [TS]
• Capacity: 15
• Min. number of students: unlimited
• 4EU+: no
• Virtual mobility / capacity: no
• State of the course: taught
• Language: Czech
• Additional information: http://[e-mail]
• Note: enabled for web enrollment
• Guarantor: prof. Mgr. Pavel Stopka, Ph.D.
• Teacher(s): Mgr. Karel Harant; prof. Mgr. Pavel Stopka, Ph.D.; Mgr. Romana Stopková, Ph.D.; Mgr. Pavel Talacko

Annotation

Last update: prof. Mgr. Pavel Stopka, Ph.D. (26.04.2021)

Proteomické praktikum MB170P112

Praktikum je rozděleno na dva bloky. V prvním, dvoudenním si účastníci projdou kompletním postupem přípravy vzorku pro necílený LC/MS experiment, použita bude SP3 metoda (1). Za účelem praktika připravíme směsné vzorky pocházející ze zajímavých myších modelů s přídavkem různých koncentrací cizorodého proteomu. V jednom experimentu tedy bude možné demonstrovat kvantifikačních schopností použité metody a její dynamický rozsah. Zároveň bude patrná změna na proteinové úrovni způsobená delecí části genu jež vede k zřetelnému fenotypu.
Vzorky budou převedeny do roztoku za přítomnosti detergentu a následně z nich enzymatickým štěpením trypsinem bude vytvořena směs peptidů připravená pro analýzu. Den vždy obsahuje teoretickou část, rozebírající jednotlivé kroky postupu a praktickou část kdy frekventanti praktika vzorky připraví. Závěrem tohoto bloku bude zahájení měření těchto vzorků na nano LC/MS Orbitrap Fusion hmotnostním spektrometru v kombinaci s kapalinovou chromatografií. Spolu s detailním seznámením se s metodou MS měření.
S časovým odstupem jednoho týdne naváže druhá čtyřdenní část zabývající se vyhodnocením naměřených dat. Použity budou volně dostupné softwarové nástroje MaxQuant (2) (https://www.maxquant.org/) pro identifikaci a kvantifikaci proteinů, Perseus (3) (https://maxquant.net/perseus/) pro statistické vyhodnocení a vizualizaci dat. Dále Vás seznámíme s programem Skyline (https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view) (4) určeným pro cílené kvantifikace peptidů. Všechny prezentované softwarové nástroje jsou pro akademické prostředí zdarma, mají grafické rozhraní a není nutné mít pro jejich použití programátorské zkušenosti. Použitý postup tedy můžete pak následně použít na vzorky se kterými se setkáte ve vaší laboratorní praxi
Závěrečné dva dny praktika pak budou zaměřeny na zpracování dat v prostředí R. Možnosti pokročilého vyhodnocení a vizualizace dat pomocí prostředí R za použití skriptů používanými pro vyhodnocování vzorků v naší laboratoři. A budou demonstrovány možnosti integrace dat pocházejících z různých OMICS metod – proteomics, transcriptomics and metabolomics


1. Hughes, C.S., Moggridge, S., Muller, T., Sorensen, P.H., Morin, G.B. and Krijgsveld, J. (2019) Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nat Protoc, 14, 68-85.
2. Cox, J., Hein, M.Y., Luber, C.A., Paron, I., Nagaraj, N. and Mann, M. (2014) Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Mol Cell Proteomics, 13, 2513-2526.
3. Tyanova, S., Temu, T., Sinitcyn, P., Carlson, A., Hein, M.Y., Geiger, T., Mann, M. and Cox, J. (2016) The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nat Methods, 13, 731-740.
4. Schilling, B., Rardin, M.J., MacLean, B.X., Zawadzka, A.M., Frewen, B.E., Cusack, M.P., Sorensen, D.J., Bereman, M.S., Jing, E., Wu, C.C. et al. (2012) Platform-independent and label-free quantitation of proteomic data using MS1 extracted ion chromatograms in skyline: application to protein acetylation and phosphorylation. Mol Cell Proteomics, 11, 202-214.

Literature

English

Last update: prof. Mgr. Pavel Stopka, Ph.D. (26.04.2021)

1.              Hughes, C.S., Moggridge, S., Muller, T., Sorensen, P.H., Morin, G.B. and Krijgsveld, J. (2019) Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nat Protoc, 14, 68-85.

2.              Cox, J., Hein, M.Y., Luber, C.A., Paron, I., Nagaraj, N. and Mann, M. (2014) Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Mol Cell Proteomics, 13, 2513-2526.

3.              Tyanova, S., Temu, T., Sinitcyn, P., Carlson, A., Hein, M.Y., Geiger, T., Mann, M. and Cox, J. (2016) The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nat Methods, 13, 731-740.

4.              Schilling, B., Rardin, M.J., MacLean, B.X., Zawadzka, A.M., Frewen, B.E., Cusack, M.P., Sorensen, D.J., Bereman, M.S., Jing, E., Wu, C.C. et al. (2012) Platform-independent and label-free quantitation of proteomic data using MS1 extracted ion chromatograms in skyline: application to protein acetylation and phosphorylation. Mol Cell Proteomics, 11, 202-214.

Requirements to the exam

Last update: prof. Mgr. Pavel Stopka, Ph.D. (19.11.2020)

Je udělován zápočet po předložení protokolu z praktik.

Syllabus

English

Last update: SVATORA (26.05.2004)

• Buffer and sample preparation. IPG strips rehydration and isoelectric focusing.

• SDS PAGE, one- and two dimensional separations, gel staining - Coomassie blue, silver salts and fluorescent dyes .

• Scanning and image analysis of gels a gel sets.

• Selection and spot-picking, tryptic digestion and peptide extraction

• Peptide mixture analysis by MS, protein identification. Database searching. Peptide fingerprinting and sequence tags. (MS and MS/MS analysis).

Czech

Last update: JPROKOP (29.11.2006)

• Příprava pufrů, vzorků, rehydratace IPG stripů, izoelektrická fokusace,

• Příprava SDS-akrylamidového gelu, jednorozměrná a dvojrozměrná elektroforéza, barvení bílkovin v gelu - Coomassie blue, stříbření a fluorescenční barvení.

• Digitalizace obrazu a obrazová analýza gelů a gelových sad.

• Výběr diferencálně exprimovaných bílkovin a jejich vypíchnutí z gelu, tryptické štěpení a extrakce peptidů.

• Analýza peptidové směsi metodami hmotnostní spektrometrie a identifikace výchozí bílkoviny. Peptidový fingerprint a sekvenční tagy (MS a MS/MS analýza).