SubjectsSubjects(version: 953)
Course, academic year 2023/2024
   Login via CAS
Practical course on proteomics - MB170C112
Title: Proteomické praktikum
Czech title: Proteomické praktikum
Guaranteed by: Department of Zoology (31-170)
Faculty: Faculty of Science
Actual: from 2020
Semester: summer
E-Credits: 2
Examination process: summer s.:
Hours per week, examination: summer s.:0/1, C [TS]
Capacity: 15
Min. number of students: unlimited
4EU+: no
Virtual mobility / capacity: no
State of the course: taught
Language: Czech
Additional information: http://pstopka@natur.cuni.cz
Note: enabled for web enrollment
Guarantor: prof. Mgr. Pavel Stopka, Ph.D.
Teacher(s): Mgr. Karel Harant
prof. Mgr. Pavel Stopka, Ph.D.
Mgr. Romana Stopková, Ph.D.
Mgr. Pavel Talacko
Annotation - Czech
Proteomické praktikum MB170P112

Praktikum je rozděleno na dva bloky. V prvním, dvoudenním si účastníci projdou kompletním postupem přípravy vzorku pro necílený LC/MS experiment, použita bude SP3 metoda (1). Za účelem praktika připravíme směsné vzorky pocházející ze zajímavých myších modelů s přídavkem různých koncentrací cizorodého proteomu. V jednom experimentu tedy bude možné demonstrovat kvantifikačních schopností použité metody a její dynamický rozsah. Zároveň bude patrná změna na proteinové úrovni způsobená delecí části genu jež vede k zřetelnému fenotypu.
Vzorky budou převedeny do roztoku za přítomnosti detergentu a následně z nich enzymatickým štěpením trypsinem bude vytvořena směs peptidů připravená pro analýzu. Den vždy obsahuje teoretickou část, rozebírající jednotlivé kroky postupu a praktickou část kdy frekventanti praktika vzorky připraví. Závěrem tohoto bloku bude zahájení měření těchto vzorků na nano LC/MS Orbitrap Fusion hmotnostním spektrometru v kombinaci s kapalinovou chromatografií. Spolu s detailním seznámením se s metodou MS měření.
S časovým odstupem jednoho týdne naváže druhá čtyřdenní část zabývající se vyhodnocením naměřených dat. Použity budou volně dostupné softwarové nástroje MaxQuant (2) (https://www.maxquant.org/) pro identifikaci a kvantifikaci proteinů, Perseus (3) (https://maxquant.net/perseus/) pro statistické vyhodnocení a vizualizaci dat. Dále Vás seznámíme s programem Skyline (https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view) (4) určeným pro cílené kvantifikace peptidů. Všechny prezentované softwarové nástroje jsou pro akademické prostředí zdarma, mají grafické rozhraní a není nutné mít pro jejich použití programátorské zkušenosti. Použitý postup tedy můžete pak následně použít na vzorky se kterými se setkáte ve vaší laboratorní praxi
Závěrečné dva dny praktika pak budou zaměřeny na zpracování dat v prostředí R. Možnosti pokročilého vyhodnocení a vizualizace dat pomocí prostředí R za použití skriptů používanými pro vyhodnocování vzorků v naší laboratoři. A budou demonstrovány možnosti integrace dat pocházejících z různých OMICS metod – proteomics, transcriptomics and metabolomics


1. Hughes, C.S., Moggridge, S., Muller, T., Sorensen, P.H., Morin, G.B. and Krijgsveld, J. (2019) Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nat Protoc, 14, 68-85.
2. Cox, J., Hein, M.Y., Luber, C.A., Paron, I., Nagaraj, N. and Mann, M. (2014) Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Mol Cell Proteomics, 13, 2513-2526.
3. Tyanova, S., Temu, T., Sinitcyn, P., Carlson, A., Hein, M.Y., Geiger, T., Mann, M. and Cox, J. (2016) The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nat Methods, 13, 731-740.
4. Schilling, B., Rardin, M.J., MacLean, B.X., Zawadzka, A.M., Frewen, B.E., Cusack, M.P., Sorensen, D.J., Bereman, M.S., Jing, E., Wu, C.C. et al. (2012) Platform-independent and label-free quantitation of proteomic data using MS1 extracted ion chromatograms in skyline: application to protein acetylation and phosphorylation. Mol Cell Proteomics, 11, 202-214.

Last update: Stopka Pavel, prof. Mgr., Ph.D. (26.04.2021)
Literature -

1.              Hughes, C.S., Moggridge, S., Muller, T., Sorensen, P.H., Morin, G.B. and Krijgsveld, J. (2019) Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nat Protoc, 14, 68-85.

2.              Cox, J., Hein, M.Y., Luber, C.A., Paron, I., Nagaraj, N. and Mann, M. (2014) Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Mol Cell Proteomics, 13, 2513-2526.

3.              Tyanova, S., Temu, T., Sinitcyn, P., Carlson, A., Hein, M.Y., Geiger, T., Mann, M. and Cox, J. (2016) The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nat Methods, 13, 731-740.

4.              Schilling, B., Rardin, M.J., MacLean, B.X., Zawadzka, A.M., Frewen, B.E., Cusack, M.P., Sorensen, D.J., Bereman, M.S., Jing, E., Wu, C.C. et al. (2012) Platform-independent and label-free quantitation of proteomic data using MS1 extracted ion chromatograms in skyline: application to protein acetylation and phosphorylation. Mol Cell Proteomics, 11, 202-214.

Last update: Stopka Pavel, prof. Mgr., Ph.D. (26.04.2021)
Requirements to the exam - Czech

Je udělován zápočet po předložení protokolu z praktik.

Last update: Stopka Pavel, prof. Mgr., Ph.D. (19.11.2020)
Syllabus -
  • Buffer and sample preparation. IPG strips rehydration and isoelectric focusing.
  • SDS PAGE, one- and two dimensional separations, gel staining - Coomassie blue, silver salts and fluorescent dyes .
  • Scanning and image analysis of gels a gel sets.
  • Selection and spot-picking, tryptic digestion and peptide extraction
  • Peptide mixture analysis by MS, protein identification. Database searching. Peptide fingerprinting and sequence tags. (MS and MS/MS analysis).

Last update: SVATORA (26.05.2004)
 
Charles University | Information system of Charles University | http://www.cuni.cz/UKEN-329.html