Last update: Krylov Vladimír, doc. RNDr. Ing., Ph.D. (23.02.2021)
Praktická cvičení jsou zaměřena na prohloubení znalostí získaných na přednáškovém kurzu z vývojové biologie. Hlavní důraz je kladen na pohlavní rozmnožování a embryonální vývoj u vybraných modelových organismů. Praktická cvičení jsou 3 denní. Během této doby mají studenti možnost si vyzkoušet mikromanipulační techniky při izolaci prasečích oocytů z vaječníků. Část izolovaných oocytů je fixována po 24 hodinách maturace (stádium metafáze I) a část je kultivována dalších 20 hodin v maturačním médiu do stádia metafáze II. Po té následuje oplození kančími spermiemi (in vitro fertilizace - IVF) a pozorování kontaktu obou gamet. Alternativní úloha pak spočívá ve studiu dynamiky akrozomální reakce u kančích spermií za pomocí Ca2+ ionoforu A23187. V rámci studia embryonálního vývoje háďítka (C. elegans) mají studenti možnost stanovit expresní domény vybraných Hox genů.
Last update: Krylov Vladimír, doc. RNDr. Ing., Ph.D. (25.01.2026)
Literature - Czech
Gilbert S.F: Developmental Biology. 10 vyd. a dřívější, Sunderland (MA): Sinauer Associates, části kapitol z 10. vyd. jsou dostupné na internetu: http://10e.devbio.com/contents.php?sub=1&art=1&full=1
Wolpert, L.: Principles of Development (2. vydání), Oxford University Press, 2002.
Krylov V. Determinace nebo regulace aneb Jak vytvořit tělo, Vesmír, 2015/2, ročník 94(145), str. 110-113.
Krylov V. Posviťte si na biologii, kapitola " Jak se staví tělo" , Nakladatelství P3K, 2014, str. 9-21 - Monografie není v prodeji. Pdf formát monografie je k dispozici na Moodle (dl2.cuni.cz) - předmět Vývojová biologie, sekce: Studijní materiál. Heslo pro vstup do kurzu: morphogen
Sládeček F.: Rozmnožování a vývoj živočichů, Academia Praha 1986
Last update: Krylov Vladimír, doc. RNDr. Ing., Ph.D. (22.04.2015)
Requirements to the exam -
The practical course is taught in Czech language.
Last update: Krylov Vladimír, doc. RNDr. Ing., Ph.D. (23.02.2021)
Praktická cvičení z vývojové biologie se budou konat od 23.2. – 13.5. 2026 v místnosti č. 108, 1. patro budovy Viničná 7. Zápis do jednotlivých třídenních paralelek (pondělí - středa) provedete přes rozhraní Moodle (vstupní klíč je: morphogen). Dále bych Vás rád požádal o zápis do kurzu Google Classroom - Praktikum z vývojové biologie. Vstupní kód: 6l3mxzhr. Přihlášení do kurzu je možné POUZE přes VÁŠ FAKULTNÍ E-MAIL, který má zřízený každý student. E-mailová adresa se skládá z loginu, který naleznete v SISu pod Vaším profilem. Dále pak následuje @natur.cuni.cz. Heslo pro vstup je shodné s heslem pro SIS nebo CAS. Platforma Google Classroom slouží jako zdroj studijních materiálů, místo pro odevzdání výstupních protokolů a taktéž jako diskuzní fórum. Zápis do tohoto kurzu je tedy velmi důležitý. Pokud budete mít jakékoliv dotazy, neváhejte a obraťte se přímo na mě (vkrylov@natur.cuni.cz).
Podmínkou zápočtu je aktivní účast na praktiku a vypracování výstupního protokolu, který bude odevzdán přes aplikaci Google Classroom - Praktikum z vývojové biologie
Termín konání : 23.2. – 13.5. 2026
Čas konání : Pondělí: 13:00 – 16:30 Úterý: 9:00 – 12:00 a 13:00 – 16:30 Středa : 9:00 – 12:00 a 13:00 – 16:30
Místo konání: Viničná 7, 1.patro, místnost č. 108
S sebou: laboratorní plášť, přezůvky, mobilní telefon a/nebo tablet s operačním systémem Android nebo iOS, popř. notebook a chuť do práce!!!
Last update: Krylov Vladimír, doc. RNDr. Ing., Ph.D. (18.02.2026)
Syllabus -
The practical course is taught in Czech language.
Last update: Krylov Vladimír, doc. RNDr. Ing., Ph.D. (23.02.2021)
I. ČÁST - ZRÁNÍ PRASEČÍCH OOCYTŮ A IN VITRO FERTILIZACE
Zrání prasečích oocytů a in vitro fertilizace
Obecný úvod
Oogeneze u savců
Samičí pohlavní buňky u savců procházejí 3 důležitými stádii:
1. Dělení - mitotický vznik oogonií (počet založen před narozením)
2. Růst - syntéza proteinů, různých mRNA a dalších důležitých komponent pro časný embryonální vývoj. Společně s rostoucím oocytem dochází ke vzniku folikulu, který svou tekutinou brání zrání oocytu. Oocyt je většinou zastaven v prometafázi I meiotického dělení. (1. meiotický blok). Jádro se nazývá zárodečný váček (GV - Germinal Vesicle).
3. Zrání - po ovulaci se oocyt uvolní z folikulu, čímž dojde k tzv. znovuzahájení meiozy. To se projeví rozpadem zárodečného váčku (GVBD-Germinal Vesicle Break Down) a posléze uspořádáním chromozómů do metafáze I. Po krátké anafázi I - telofázi I oocyt vyčkává na oplození většinou v metafázi II, kdy je možné pozorovat vyloučené 1. pólové tělísko. Přechody mezi jednotlivými fázemi jsou hlavně řízeny CDK1 (Cdc2) a cyklinem B, které dohromady tvoří MPF (Maturation Promoting Factor). Hladina jeho aktivní formy je nejvyšší v metafázi I a hlavně v metafázi II. V období anafáze I - telofáze I je naopak hladina této formy nejnižší. U savců je oocyt až do oplození většinou zastaven v metafázi II (2. meiotický blok). Po uvolnění z prostředí folikulu dochází GVBD do 6-ti hodin. Metafáze I je pozorovatelná mezi 20 - 24 hodinou. Metafáze II pak mezi 42-48 hodinou od izolace.
Oplození u savců
Spermie v pohlavním traktu samice u savců procházejí procesem kapacitace. Po té jsou schopné oplození. Ke kontaktu spermie a oocytu dochází zhruba v horní třetině vejcovodu. Spermie překoná vrstvy kumulárních buněk a po kontaktu se zónou pellucidou dochází k akrozomální reakci (vylití proteolytických enzymů). Po průniku spermie do oocytu nedochází u savčích oocytů ke klasickému rychlému bloku polyspermie (změna polarity oocytární membrány), který známe od ježovky. Ten nemusí být tolik potřebný vzhledem k relativně malému počtu spermií, které se k oocytu dostanou. Dochází však k vylití tzv. kortikálních granulí z oocytu (ekvivalent pomalého bloku polyspermie) a dlouhodobému zabránění vazby a průniku dalších spermií přes zonu pellucidu. Tento proces proběhne mezi 30-60 minutami po oplození a během této doby dojde i ke změnám na plasmatické membráně, které znemožní průnik spermií do cytoplasmy. Průnikem spermie do oocytu dojde pak k jeho aktivaci oscilacemi Ca2+ iontů a k dokončení meiozi. Vzniká tak postupně samičí prvojádro. Současně hlavička spermie začíná dekondenzovat do podoby samčího prvojádra. U obou prvojader po té dochází k syntéze DNA. U savců, na rozdíl např. od ježovky, nedochází v tomto okamžiku k jejich fúzi ale k oddělené kondenzaci do chromozómů v rámci profáze. Po té jsou samčí a samičí chromozómy promíchány v ekvatoriální rovině a během anafáze a telofáze vznikají dvě pravá somatická jádra.
Praktická část
Úkol pro 1. den
Izolace prasečích oocytů z folikulů aspirační metodou.
Folikuly vaječníku nabodneme injekční stříkačkou s jehlou a odsáváme folikulární tekutinu, která obsahuje volné oocyty obalené vrstvami kumulárních buněk. Uděláme si také foto vaječníku pod stereomikroskopem (obr. I). Po té aspirovanou tekutinu přeneseme do víčka 3 cm Petriho misky.
Pod stereobinolupou skleněnou kapilárou nasáváme jednotlivé oocyty, které přenášíme do druhé 3 cm Petriho misky se 4 kapkami (4 x 50 µl) manipulačního média (M2) pod olejem. Izolované oocyty prohlížíme pod stereobinolupou. Prasečí oocyty jsou tmavé (lipidová granula) a jsou obaleny několika vrstvami kumulárních buněk. Oocyty si následně vyfotíme pod stereomikroskopem do tabla (obr. A). Oocyty spočítáme a rozdělíme do dvou skupin. 1. skupina by měla odpovídat cca 1/3 z celkového počtu vámi vyizolovaných oocytů a je určena pro fixaci po 24 hodinách kultivace (stádium metafáze I). Ve 2. skupině by měly být zbylé 2/3 oocytů a ty necháme kultivovat 42-48 hodin do stádia metafáze II s následným in vitro oplozením kančími spermiemi.
1. skupinu oocytů přeneseme skleněnou kapilárou do 4-jamkové destičky s 500 ml média M199 se 4 mg/ml GPBoS (růstové proteiny bovinního séra) překrytého 500 µl parafinového oleje. 2. skupinu obdobně přeneseme do druhé 4-jamkové destičky se stejným médiem. Při přenosu dáváme pozor, abychom oocyty přenesli do média na dně jamky, a nevypustili je do oleje nad médiem. Jamky s oocyty si označíme. Poté obě destičky kultivujeme v termostatu při teplotě 38,5 °C a 5% CO2.
Úkol pro 2. den
Fixace 1. skupiny oocytů po 24 hodinové maturaci
Z termostatu vyjmeme 4 jamkovou destičku s oocyty určenými pro fixaci v metafázi (1. skupina oocytů) a rychle vyfotíme pod stereomikroskopem (obr. B). Do každé z jamek napipetujeme á 25 ml 0,1% hyázy (Hyaluridonáza) a zamícháme. Tento enzym rozvolní expandovaný kumulus a umožní odstranění jeho buněk. Asi po 3-5 minutách oocyty přeneseme do kapky manipulačního média (M2) v 3 cm Petriho misce a odstraníme zbylé kumulární buňky protahováním tenkou skleněnou kapilárou. Po očištění si všímáme poměrně silné zóny pellucidy, která je dobře patrná při polovičním zástinu. Oocyty poté přeneseme do 500 µl 4% roztoku formaldehydu v PBS, který budete mít ve 4-jamkové destičce, a zde je fixujeme do dalšího dne při 4 °C.
Úkoly pro 3. den
1. In vitro fertilizace
Spermie určené pro in vitro fertilizaci označíme vitálním barvením jádra a mitochondrií (Hoechst 33258 + Mitotracker Red CMX Ros) následujícím způsobem.
Odpipetujeme 3 ml spermií do 10 ml zkumavky s modrým uzávěrem. Zkumavku centrifugujeme při 700G (2.650 ot/min – centrifuga MPW-340) po dobu 5 minut. Pasteurovou pipetou odebereme supernatant a přidáme 7 ml sterilního PBS + 0,01% PVA (polyvinylalkohol) z lahvičky. Vše důkladně zamícháme a centrifugujeme 5 minut při 700 G. Tento krok opakujeme ještě jednou. Na závěr odsajeme supernatant a spermie velmi důkladně resuspendujeme ve 2 ml PBS + 0,01% PVA. Z této suspenze si co nejdříve přeneseme 500 µl do 1,5 ml ependorfky a přidáme 5 µl Mitotrackeru (1 mM roztok v DMSO) a 2 µl Hoechst 33258 (1 mg/ml). Důkladně zamícháme a necháme inkubovat při 17 °C. Tyto spermie budeme po používat na umělé oplození (po alespoň 30 minutách inkubace) a pro pozorování samotných spermií (po 1-2 hodinách inkubace).
Do další 1,5 ml ependorfky napipetujeme 990 µl destilované vody. Z původní suspenze ve zkumavce odebereme 10 µl, které přidáme do ependorfky s vodou a důkladně promícháme (spermie jsou nyní 100 x ředěné a jsou znehybněné). Takto vzniklá suspenze je určená pro počítání spermií. Zbytek původní suspenze odložíme do boxu s teplotou 17 °C.
Zjištění koncentrace spermií na mililitr provedeme následujícím způsobem. Ze 100x ředěné suspenze (v ependorfce s vodou) odebereme 10 µl a aplikujeme je mezi krycí a podložní sklo Burkerovy komůrky. Komůrku umístíme do mikroskopu a spočítáme spermie, které se nacházejí v 16 velkých čtvercových polích (oblast je ohraničena trojitou rýhou). Nepočítáme ty spermie, které leží mezi velkými čtverci. Postup opakujeme ještě 3 x, vždy na jiných místech Burkerovy komůrky. Výsledné čtyři hodnoty zprůměrujeme. Koncentraci spermií na ml vypočteme podle následujícího vzorečku:
X = (průměrný počet spermií v 16 velkých polích) x 15 625 x 100
Vysvětlení výpočtu:
Plocha jednoho velkého čtverce = 0,04 mm2 , hloubka komůrky = 0,1 mm
Objem tekutiny nad jedním velkým čtvercem = 0,04 x 0,1 = 0,004 mm3 (µl)
Objem tekutiny nad 16 velkými čtverci = 0,004 x 16 = 0,064 mm3 (µl)
Přepočet na 1 cm3 (ml) = 1000 / 0,064 = 15 625 (koeficient ve vzorečku)
Suspenzi jsme 100 x ředili. Proto je nutné výslednou hodnotu vynásobit.
Zatímco část skupiny počítá spermie, zbylí členové si vyndají 4-jamkovou destičku s oocyty maturovanými do metafáze 2, vyfotí je (obr. C) a očistí tyto oocyty maturované 42-48 hodin od kumulárních buněk stejným způsobem jako v případě oocytů určených pro fixaci po 24 hodinách zrání. Očištěné oocyty dále pozorujeme pod stereobinolupou a pokoušíme se nalézt 1. pólové tělísko, které se nachází pod zónou pellucidou jako kulovitý útvar, oocyt s viditelným pólovým tělískem vyfotíme (obr. F). Přítomnost pólového tělíska značí, že oocyt je maturovaný a zastavený v metafázi II. Oocyty si rozdělíme na dvě poloviční skupiny. Přičemž 1. skupina se bude fixovat 1-2 hodiny v 500 µl 4% roztoku formaldehydu v PBS, který budete mít ve 4-jamkové destičce (stejně jako oocyty v metafázi 1) při pokojové teplotě. 2. skupinu použijeme na umělé oplození.
Máme již připravené vitálně značené spermie, v ependorfce v 17 °C. Každá skupina bude mít k dispozici pro oplození jednu jamku s 500 µl média mTBM se 2 mg BSA/ml (IVF médium). Ze suspenze značených spermií odebereme tolik µl aby po naředění do 500 µl mTBM média byla výsledná koncentrace 500.000 spermií/ml. Vše opatrně zamícháme a do jamky se spermiemi přidáme 2. skupinu očištěných oocytů. Vše necháme inkubovat 1-2 hodiny v termostatu při teplotě 38,5 °C, 5% CO2. Poté pozorujeme kontakt obou gamet pod stereobinolupou a následně pod fluorescenčním mikroskopem (obr. H). Přípravu preparátu provedeme stejným způsobem jako v případě pozorování fluorescenčně značených oocytů ve stádiu MI a MII (viz níže, bod 2).
Pro pozorování vitálně barvených spermií si připravíme očištěné podložní a krycí sklo. Spermie inkubované v ependorfce při 17 °C naředíme 1:1 s roztokem 4% formaldehydu v PBS. To provedeme tak, že do nové ependorfky si napipetujeme 500 µl 4% roztoku formaldehydu a přidáme 500 µl značených spermií. Na podložní sklo naneseme 20 µl výsledné suspenze spermií a přiklopíme krycím sklem. Preparát orámujeme lakem na nehty a po důkladném zaschnutí pozorujeme pod fluorescenčním mikroskopem. Hlavičky spermií jsou obarveny modře (Hoechst 33258), krček a část mid-piece je značen červeně (Mitotracker). Spojením fotografií z jednotlivých fluorescenčních kanálů a fotografie z fázového kontrastu dostane výslednou fotografii (obr. G).
2. Barvení preparátů fixovaných oocytů po 24 (MI) a 42-46 (MII) hodinách maturace
Vyrobíme si 2 oplachové misky tak, že naneseme na obě poloviny, dno i víčko, 3cm Petriho misky 2 kapky PBS + PVA. Misky si označíme popisem MI a MII. Do první kapky na obou miskách přeneseme oocyty z fixáže ve 4-jamkových destičkách (jedna je z 1. dne=oocyty v MI, druhá z dopoledne=oocyty v MII) a necháme 5 minut inkubovat. Pak přeneseme oocyty do 2. kapky a opět 5 minut inkubujeme.
Připravíme si stejným způsobem 2 podložní skla, označíme si je MI a MII. Z etanolové lázně vyjmeme podložní skla, osušíme a vyleštíme, dále si vyleštíme skla krycí. Podle velikosti krycího skla naneseme do „budoucích rohů“ trochu vazelíny z připravené injekční stříkačky. Do středu pole vymezeného vazelínou napipetujeme 10 µl montovacího media s DAPI. Do kapky tohoto média přeneseme opláchnuté oocyty a necháme cca 2 minuty promísit. Opatrně přiložíme očištěné krycí sklo a pinzetou jemně tlačíme na jeho rohy (v místech, kde se nachází vazelína). Přitlačujeme zhruba do doby, než původní kapka manipulačního média zdvojnásobí svůj průměr. (POZOR VŠAK NA PŘÍLIŠNÝ TLAK – OOCYTY SNADNO PRASKAJÍ.) Poté velmi opatrně orámujeme krycí sklo lakem na nehty a necháme zaschnout. Při nanášení laku se snažte zabránit posunutí krycího skla. (Pod fluorescenční mikroskop preparát dávejte až v okamžiku, kdy je lak zcela zaschlý.) Pod mikroskopem se poté snažíme najít chromozomy v metafázi na sklíčku s popisem MI (obr. D) a metafázi s pólovým tělískem na sklu MII (obr. E).
II. ČÁST - EMBRYONÁLNÍ VÝVOJ C. ELEGANS
Háďátko Caenorhabditis elegans
Caenorhabditis elegans patří mezi volně žijící nepatogenní hlístice. V přírodě jej najdeme v půdě, kde se živí bakteriemi. U háďátka rozlišujeme dvě pohlaví - převažující hermafrodity se schopností samooplození (kombinace pohlavních chromozómů XX) a zřídka se vyskytující samce (0.05% populace, kombinace pohlavních chromozómů X0). V laboratoři je C. elegans významným modelovým organizmem. Na jedné straně je to reprezentant mnohobuněčných eukaryot, na druhé straně má jednoduché průhledné tělo, které umožňuje studovat celou řadu procesů přímo v živém organizmu. Háďátko se také snadno pěstuje v laboratoři a má krátkou generační dobu (3-4 dny). Embryonální vývoj je determinační, s přesně daným počtem buněk, takže je možné sledovat vývoj každé jednotlivé somatické buňky. Dospělý hermafrodit má 959 somatických buněk, zatímco u dospělého samce jich je 1031. Homeotické geny (Hox) kódují transkripční faktory, jejichž typickou součástí je evolučně konzervovaná DNA vazebná oblast nazývaná homeodoména. Hox geny hrají klíčovou úlohu v určení předozadní osy těla a v rozdělení těla na jednotlivé segmenty. U C. elegans došlo ke ztrátě některých Hox genů, navíc je zde exprese Hox genů více závislá na typu buněk než na konkrétní pozici v rámci těla. I přes tyto změny jsou Hox geny důležité pro určení osudu buněk. Vaším úkolem je detegovat expresi tří různých Hox genů v C. elegans: mab-5 (ftz, fushi tarazu), lin-39 (Scr, sex combs reduced or Hox5) and egl-5 (Abd-B, abdominal B). Dostanete linie háďátek nesoucí lacZ reporter, jehož exprese je vždy řízena promotorem jednoho z výše zmíněných genů.
• Spláchněte háďátka z petriho misky 800μl pufru M9 • Centrifugujte 1000g/30 sec ~ 3000 rpm / 30 sec., opatrně odsajte supernatant • Přidejte 800 μl dH2O, centrifugujte, opatrně odsajte supernatant • Sušte ve speedvacu 20 min. • Inkubujte ve 300 μl acetonu (na ledu) 2 min. 2x, vždy centrifugujte a odsajte supernatant • Nechte zbylý aceton vytěkat • Přidejte 250 μl barvicího roztoku, nechte vyvíjet, chraňte před světlem • Reakci zastavte přidáním 800 μl pufru M9, centrifugujte a odsajte supernatant • Zhotovte preparát a pozorujte pod mikroskopem
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) je fluorescenční barva vázající se na DNA, takže se využívá k barvení jednotlivých chromozómů i celých jader Vám toto jednoduché barvení umožní lepší orientaci v morfologii různých vývojových stádií háďátka.
Last update: Krylov Vladimír, doc. RNDr. Ing., Ph.D. (25.01.2026)
Learning outcomes -
At the end of the practical course, the student will be able to:
1.Remember
List the basic stages of oogenesis in mammals (oogonial proliferation, oocyte growth, maturation) and describe in which meiotic stage the oocyte is before and after ovulation (GV, MI, MII), to the extent necessary for independent preparation of an image panel.
State the time intervals required to reach metaphase I (20–24 h) and metaphase II (42–48 h) during in vitro maturation of porcine oocytes and use them appropriately when planning laboratory cultures.
List the main components of the maturation‑promoting factor (MPF), i.e. CDK1 and cyclin B, and indicate the stages in which MPF activity is highest and lowest in the text part of the protocol.
List the three monitored Hox genes in Caenorhabditis elegans (mab-5, lin-39, egl-5) and assign to them the corresponding reporter lines provided in the practical course.
2.Understand
Explain why a mammalian oocyte is arrested in metaphase II (second meiotic block) prior to fertilization and how sperm entry (Ca2+ oscillations) trigger completion of meiosis.
Orally describe the difference between the fast and slow block to polyspermy and justify why, in mammals, the cortical reaction predominates over the rapid change in membrane potential.
Interpret the basic morphological features of MI and MII stages of porcine oocytes (presence/absence of the polar body, chromosome arrangement) in the acquired images and label these features in the panel.
Describe in general terms the role of Hox genes in establishing the body axis and cell fates and explain how the organization and role of Hox genes in C. elegans differ from the typical segmented model.
3.Apply
Practically perform the isolation of porcine oocytes from ovarian follicles using the aspiration method, work correctly under a stereomicroscope, and safely divide the collected oocytes into two groups (MI, MII).
Apply the basic principles of handling oocytes and culture media (M2, maturation medium) when setting up oocyte incubation (38.5°C, 5% CO2) so that oocyte viability is maintained for 24 and 42–48 hours for further use.
Independently prepare a sperm suspension for IVF: take a sample, determine sperm concentration using a Bürker chamber, calculate the required dilution, and prepare a working suspension at a concentration suitable for in vitro fertilization.
Perform staining of sperm (Hoechst 33258, Mitotracker Red) or oocytes (formaldehyde fixation) according to the given protocol, including correct centrifugation, washing, and sample handling, and document the results in a series of microscopic images.
4.Analyze
Based on images and personal observations, distinguish and describe morphological differences among porcine oocytes at the GV, MI, and MII stages, including identification of the polar body and metaphase chromosomes, and systematically summarize these differences in the image panel.
Evaluate the course of IVF: identify cases of sperm–oocyte contact and early stages of fertilization in fluorescence images (position of the sperm head, mitochondria) and distinguish specific signals from possible staining artefacts or autofluorescence.
Analyze the spatial expression pattern of the lacZ reporter for individual Hox genes (mab-5, lin-39, egl-5) in C. elegans.
Compare the observed Hox gene expression with the expected domains derived from the literature or the introductory theoretical part of the practical course and discuss possible reasons for discrepancies (e.g. technical limitations of staining, developmental stage, variability among individuals).
5.Create
Compile a clear image panel capturing key stages of oocyte maturation, the course of IVF, and Hox gene expression patterns in C. elegans, supplemented with brief captions that relate to theoretical concepts from developmental biology lectures.
Formulate one specific research question concerning the regulation of meiosis, blocks to polyspermy, or spatial expression of Hox genes in C. elegans.
6.Evaluate
Critically evaluate their own laboratory work (oocyte isolation, staining, work with C. elegans).
Assess the quality of the obtained images and data (sharpness, contrast, reproducibility) and decide which data are sufficiently reliable and which must be designated as preliminary.
Evaluate the contribution of the individual model organisms (porcine oocyte, C. elegans) to the study of developmental processes.
Last update: Tlapáková Tereza, RNDr., Ph.D. (29.01.2026)
Na konci praktického cvičení bude student schopen:
1. Zapamatování
·Vyjmenovat základní fáze oogeneze u savců (dělení oogonií, růst oocytu, zrání) a popsat, ve kterém meiotickém stadiu je oocyt před a po ovulaci (GV, MI, MII), v rozsahu potřebném pro samostatné vypracování obrazového tabla.
·Uvést časové intervaly potřebné k dosažení stadií metafáze I (20–24 h) a metafáze II (42–48 h) při in vitro maturaci prasečích oocytů a odpovídajícím způsobem je použít při plánování kultivací v laboratoři.
·Vyjmenovat hlavní komponenty maturation-promoting faktoru (MPF), tj. CDK1, cyklin B, a označit stádia, v nichž je aktivita MPF nejvyšší a nejnižší, v textové části protokolu.
·Vyjmenovat tři sledované Hox geny u Caenorhabditis elegans (mab-5, lin-39, egl-5) a přiřadit k nim odpovídající reportérové linie poskytnuté v praktickém cvičení.
·Vysvětlit, proč je savčí oocyt před oplozením zastaven v metafázi II (2. meiotický blok) a jak vstup spermie (Ca2+ oscilace) spouští dokončení meiózy.
·Slovně popsat rozdíl mezi rychlým a pomalým blokem polyspermie a odůvodnit, proč u savců převažuje kortikální reakce nad rychlým změněním membránového potenciálu.
·Interpretovat základní morfologické znaky stadií MI a MII prasečích oocytů (přítomnost/absence pólového tělíska, uspořádání chromozomů) na pořízených snímcích a tyto znaky označit v tablu.
·Popsat v obecné rovině roli Hox genů v určení tělní osy a buněčných osudů a vysvětlit, v čem se organizace a role Hox genů u C. elegans liší od typického segmentovaného modelu.
·Prakticky provést izolaci prasečích oocytů aspirační metodou z folikulů vaječníku, správně pracovat pod stereomikroskopem a bezpečně rozdělit získané oocyty do dvou skupin (MI, MII).
·Aplikovat základní principy manipulační práce s oocyty a kultivačními médii (M2, maturační médium) při nastavení inkubace oocytů (38,5°C, 5% CO2) tak, aby bylo možné po dobu 24 a 42–48 hodin udržet životaschopnost oocytů pro další použití.
·Samostatně připravit suspenzi spermií pro IVF: odebrat vzorek, stanovit koncentraci spermií v Bürkerově komůrce, spočítat potřebné ředění a připravit pracovní suspenzi v koncentraci vhodné pro oplození in vitro.
·Provést barvení spermií (Hoechst 33258, Mitotracker Red) nebo oocytů (fixace formaldehydem) podle zadaného protokolu, včetně správného odstředění, promývání a manipulace se vzorkem, a výsledky zdokumentovat sérií mikroskopických snímků.
·Na základě snímků a vlastních pozorování rozlišit a popsat morfologické rozdíly mezi prasečími oocyty ve stadiu GV, MI a MII, včetně identifikace pólového tělíska a chromozomů metafáze, a tyto rozdíly systematicky shrnout v obrazovém tablu.
·Vyhodnotit průběh IVF: identifikovat případy kontaktu spermií s oocytem a rané stavy fertilizace na fluorescenčních snímcích (pozice hlavičky, mitochondrií) a odlišit specifické signály od možných artefaktů barvení či autofluorescence.
·Analyzovat prostorový vzorec exprese lacZ reportéru pro jednotlivé Hox geny (mab-5, lin-39, egl-5) u C. elegans.
·Pozorovanou expresi Hox genů s očekávanými doménami vyplývajícími z literatury či úvodní teoretické části praktika a diskutovat možné příčiny rozdílů (např. technické limity barvení, vývojové stádium, variabilita mezi jedinci).
·Sestavit přehledné obrazové tablo zachycující klíčová stádia zrání oocytů, průběh IVF a vzorce exprese Hox genů u C. elegans, doplněné stručnými popisky, které navazují na teoretické koncepty z přednášek vývojové biologie.
·Formulovat jedno konkrétní badatelské otázkové zadání (research question) týkající se regulace meiózy, bloků polyspermie nebo prostorové exprese Hox genů u C. elegans.
·Kriticky zhodnotit vlastní laboratorní práci (izolace oocytů, barvení, práce s C. elegans).
·Posoudit kvalitu získaných obrázků a dat (ostrost, kontrast, reprodukovatelnost) a rozhodnout, která data jsou dostatečně spolehlivá a která je nutné označit jako orientační.
·Zhodnotit přínos jednotlivých modelových organismů (prasečí oocyt, C. elegans) pro studium vývojových procesů.
Last update: Tlapáková Tereza, RNDr., Ph.D. (29.01.2026)
