The lecture is focused on description of basic methods and strategies exploited in genetic engineering of both caryotic and aucaryotic organisms in vitro, and in vivo. The main groups of methods are isolation of DNA or RNA, chemical and biochemical synthesis of oligonucleotides and polynucleotides, construction of large ds DNA in vitro, degradation and modification of DNA, reverse, transcription, amplification of DNA by PCR, recombination of DNA in vitro, DNA transformation of cells with isolated DNA, analysis of recombinant DNA and selection of recombinant molecules, viruses, cells or multicellular organisms. The main strategies are following: Selection strategies, site-specific and random mutagenesis, deletion mutagenesis, cloning, preparation and exploitation of DNA or c-DNA libraries, expression of foreign genes, constructions of various types of vectors, sequencing and genetic manipulation in vivo. The methods and strategies are demonstrated mostly on E. coli and S. cerevisiae.
Last update: Vopálenský Václav, Mgr., Ph.D. (28.08.2017)
V přednášce jsou popisovány jak základní tak i pokročilejší metody genově inženýrských přístupů a manipulací eukaryotických a prokaryotických organizmů. Přednáška je primárně zaměřena po popis principů a využití klasických genově inženýrských metod, jakožto nezbytného základu experimentální práce v laboratořích molekulárně biologického zaměření.
Mezi hlavní témata této přednášky patří izolace nukleových kyselin z odlišných typů buněk či tkání; chemická a biochemická syntéza nukleových kyselin včetně PCR a RT-PCR; degradace a modifikace DNA i RNA; využití restrikčních endonukleáz k přípravě rekombinantních molekul DNA; charakterizace a konstrukce rekombinantních vektorů; rekombinace DNA in vitro i in vivo; transformace různých typů buněk molekulami DNA i RNA; strategie selekce rekombinantních molekul, virů a buněk; místně specifické mutageneze a mutageneze in vivo; různé sekvenační postupy; konstrukce genomových a cDNA knihoven; strategie exprese cizorodých proteinů v různých expresních systémech; rozličné způsoby analýzy genové exprese; umlčování genů pomocí RNA interference; možnosti modifikace eukaryotických genomů in vivo a praktické využití genově inženýrských přístupů.
Metody a strategie jsou demonstrovány jak na in vitro systémech, tak i na systémech in vivo v bakteriích (E. coli) nižších eukaryotech (S. cerevisiae) a na tkáňových kulturách eukaryot vyšších.
Last update: Vopálenský Václav, Mgr., Ph.D. (24.08.2022)
Literature -
· Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press
· J. Sambrook, D. Russell - Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition / Fourth Edition, CSHL Press)
· (V. Vondrejs; Otazníky kolem genového inženýrství, Academia 2010)
· Brown T.A. (2006, 2010) Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction; Blackwell Publishing Incorporated
· T. Nicholl - An Introduction to Genetic Engineering, Third Edition (2008)
· S.B. Primrose – Principle of gene manipulation and genomics, Seventh Ed. (2006)
· různé firemní „aplikační“ manuály
· různé firemní „TechNotes“
Prezentace k přednášce, které jsou přihlášeným studentům dostupné na http://web.natur.cuni.cz/~pospisek/vyuka/vyuka.htm, přístupový klíč je studentům sdělen vždy na začátku přednáškového cyklu.
Last update: Vopálenský Václav, Mgr., Ph.D. (28.08.2017)
Requirements to the exam -
The exam is usually written. It is necessary to write an answer to the questions (about 10 in total), so it is not a simple ticking of answers. Test timeout is 120 minutes. Scoring of answers is based on the difficulty of the questions (4-3-3-2-2-2-1-1-1-1 points can be obtained for individual questions, ie 20 points in total). The classification is as follows: 18-20 points = excellent; 15-17.5 points = very good; 12-14.5 points = good; less than 12 points = failed.
Last update: Vopálenský Václav, Mgr., Ph.D. (25.10.2019)
Zkouška je obvykle písemná, znalosti vyžadované k jejímu úspěšnému složení vycházejí z probírané látky. Na položené otázky (celkem cca 10) je třeba vypsat odpověď, nejedná se tedy o prosté zaškrtávání odpovědí. Časový limit testu je 120 minut. Bodové hodnocení odpovědí vychází z náročnosti otázek (za jednotlivé otázky lze obvykle získat 5-3-3-2-2-2-1-1-1 bod, celkem tedy 20 bodů). Klasifikace je následující: 18-20 bodů = výborně; 15-17,5 bodu = velmi dobře; 12-14,5 bodu = dobře; méně než 12 bodů = neprospěl/a.
Last update: Vopálenský Václav, Mgr., Ph.D. (28.08.2017)
Syllabus -
Lecture 1 - Introduction to the Genetic Engineering (GE); advantages x disadvantages of GE, basic principles of GE, history of GE (1953-2019), horizontal gene transfer (basics of conjugation, transduction, transformation, induced protoplast fusion
Lecture 2 - Purification of nucleic acids (NA); cell lysis, purification/concentration of nucleic acid, isolation of plasmid DNA, RNA isolation
Lecture 3 - Separation of nucleic acids; DNA/RNA electrophoresis, purification of DNA fragments from agarose gels, spectrophotometric quantitation of NA, chemical synthesis of oligonucleotides, biochemical synthesis of DNA
Lecture 4 – PCR; history of the PCR, components of PCR reaction mix, thermal profile of PCR , PCR inhibitors, PCR optimization, PCR variants
Lecture 5 - RT-PCR; DNA fragmentation; mechanical fragmentation of DNA, sequence non-specific degradation of DNA, sequence specific degradation of DNA, nicking / homing endonucleases
Lecture 6 - Modification of DNA ends; nucleases an polymerases and mode of their action, labelling of DNA ends using Klenow fragment and T4 DNA polymerase, working with DNA linkers and adaptors, labelling of NA
Lecture 7 - DNA cloning; ligation history, ligases, cloning of cohesive and of blunt ends, vectors, features of vectors
Lecture 8 - Transfection of DNA into organisms, electroporation, lipofection, transient x stable transformation (selectable markers); Mutagenesis - chemical mutagens, mutagenic PCR oligonucleotide-directed mutagenesis; sequencing - Maxam-Gilbert and Sanger sequencing, pyrosequencing
Lecture 9 - RNA transcription, Protein expression systems - of E. coli based expression system, problems with expression in E.coli, in vitro translation systems, couplet in vitro transcription/translation, laboratory strains of E. coli used in GI
Lecture 10 - Genetic manipulations in eukaryotes (mainly in Saccharomyces cerevisiae (S.c.)), vectors, yeast transformation, homologous recombination in yeast, mutagenesis in vivo, expression of a foreign gene in yeast, expression of a foreign gene in mammals cell lines, vectors and promoters used for expression
Lecture 11 - Protein interaction technologies; the two hybrid screen, co-immunoprecipitation, GST pull-down assays; Preparation of genomic and cDNA libraries
Lecture 12 - Genome modification in vivo - Zinc Finger Nucleases, TALEN, CRISPR/Cas9
Lecture 13 - Analyses of gene expression, Northern blotting, mapping RNA with nuclease I, mapping-protein-binding sites by DNAseI foot-printing, gel retardation assays, gene therapy
Last update: Vopálenský Václav, Mgr., Ph.D. (25.10.2019)
1. Stručný úvod do Genového inženýrství; historické milníky, modelové organismy využívané v GI, výhody/nevýhody jejich využití; porovnání klasických a netradičních genetických metod. Základní sled kroků pro umělý přenos genetické informace mezi buňkami pomocí metod GI a možnosti úniku z tohoto sledu.
2. Metody izolace nukleových kyselin z virů, organel a buněk; principy a přístupy s ohledem na vstupní materiál a následné využití nukleových kyselin. Přečistění nukleových kyselin. Izolace plazmidové DNA.
3. Principy separace NK; základy elektroforetických, centrifugačních a separačních technik, stanovení koncentrace a čistoty NK, principy separace proteinů. Chemická syntéza nukleových kyselin.
4. Syntéza NK; termolabilní polymerázy (posun přerušení, metoda náhodných primerů), Polymerázová řetězová reakce (historie, princip, fáze a průběh, složky PCR směsi, aditiva, problémy spojené s PCR).
5. PCR; varianty PCR (RACE, asymetrické PCR, in situ PCR, značení DNA pomocí PCR, multiplex PCR, mutagenní PCR, hot start PCR apod.), PCR s degenerovanými primery. Přepis RNA do cDNA (reverzní transkripce), různé varianty kvantitativního PCR (RQ-PCR), RACE-PCR. Metody fragmentace DNA - mechanická degradace (střižné napětí, ultrazvuk), enzymatická fragmentace DNA (sekvenčně nespecifická fragmentace nukleových kyselin)
6. Sekvenčně specifické degradace nukleových kyselin; restrikční endonukleázy (RE), restrikčně-modifikační systémy I-III, detailní popis RM systému II (klasifikace RE podle způsobu štěpení, rozeznávané palindromatické sekvence, typy konců generovaných RE a jejich využití při klonování, podmínky a problémy restrikčního štěpení, zastavení účinku RE, distribuce velikosti fragmentů).
7. Enzymy pro syntézu, modifikaci, spojování a úpravy konců DNA; aktivity, využití, výhody a nevýhody vybraných enzymů (např. Klenowův fragment DNA polymerázy I, T4 DNA polymeráza, Mung-Bean, Bal 31), kinázy, alkalické fosfatázy apod.). Využití polylinkerů a spacerů při klonování a úpravě nukleových kyselin. Radioaktivní a neradioaktivní značení nukleových kyselin, příprava sond, Southern blot, detekce.
8. Rekombinace fragmentů s vektorem in vitro; vektory rozdělení; vektory plasmidového typu; fagemidy, vektory odvozené od fága lambda (substituční, inserční), kosmidy, P1 vektory, PAC, BAC, YAC vektory. Ligázy, klonování kohezních a tupých konců.
9. Klonování genů; klonováni PCR fragmentů, klonování nezávislé na ligaci (LIC), GATEWAY systém, detekce rekombinantních klonů. Vnášení nukleových kyselin do organismů - transformace bakterií; transformace savčích a rostlinných buněk, stabilní a transientní transformace, Flp-In systém přípravy stabilních linií.
10. Mutageneze; chemické mutageny; vnášení mutací do NK pomocí enzymatických reakcí, oligonukleotidem řízena mutageneze, mutageneze pomocí PCR. Sekvenování DNA – metoda chemického štěpení, metoda terminace řetězce. Transkripce in vitro transkripce.
11. Exprese cizorodých proteinů; charakterizace expresních systémů; expresní systém odvozený od E. coli (výhody a nevýhody exprese v E. coli, expresní vektory se zaměřením na výběr vhodného promotoru, expresní kazety, možnosti izolace rekombinačních proteinů z buněk, optimalizace produkce obtížně se exprimujících proteinů). Translace in vitro. Významné laboratorní kmeny E. coli.
12. Genové inženýrství u eukaryot se zaměřením na kvasinku S. cerevisiae;stručný popis modelového systému S. cerevisiae (kmeny, využití podvojných vektorů, integrativní vektory, příprava knock-out kmenů, kvasinkové expresní systémy, cílená mutageneze in vitro). Expresní systémy založené na bakulovirových vektorech a tkáňových liniích, příprava genomových a cDNA knihoven.
