Specialized practical course of molecular methods in plant systematics and population biology. Two methods will
be demonstrated: microsatellites and DNA sequencing. The course includes lab work, evaluation of the data from
sequencer, data analysis and presentation. The basics of next-generation (NGS) sequencing libraries and NGS
data analysis are also demonstrated.
The course is established within the project CZ.02.2.69/0.0/0.0/18_056/0013322 with the name ‘ESF pro VŠ II na
UK‘.
Last update: Štefánek Michal, Mgr. (31.05.2020)
Praktická výuka metod sekvenování DNA a mikrosatelitů s důrazem na jejich využití v systematice a populační
biologii rostlin. Kurz je koncipován formou vědeckého projektu a zahrnuje přípravu projektu, práci v laboratoři,
interpretaci dat ze sekvenátoru a přípravu datových matic, vyhodnocování dat a celkové vyhodnocení a prezentaci
projektu. Kromě hodnocení klasických sekvenačních a mikrosatelitových dat je kurz věnován i základům přípravy
knihoven pro next-generation sequencing (NGS) a analýzy NGS dat.
Předmět je vyučován v rámci projektu CZ.02.2.69/0.0/0.0/18_056/0013322 s názvem ESF pro VŠ II na UK.
Last update: Štefánek Michal, Mgr. (31.05.2020)
Literature -
Weising K. et al. (2005): DNA fingerprinting in plants. Principles, methods, and applications. 2nd edition.
Caetano-Anollés G. & Gresshoff P.M. (1998): DNA markers. Protocols, applications, and overviews.
Hall B.G. (2001): Phylogenetic trees made easy.
Last update: Štefánek Michal, Mgr. (31.05.2020)
Weising K. et al. (2005): DNA fingerprinting in plants. Principles, methods, and applications. 2nd edition.
Caetano-Anollés G. & Gresshoff P.M. (1998): DNA markers. Protocols, applications, and overviews.
Hall B.G. (2001): Phylogenetic trees made easy.
Last update: Štefánek Michal, Mgr. (31.05.2020)
Requirements to the exam -
Write out protocols from the practical part.
Last update: Štefánek Michal, Mgr. (31.05.2020)
Vypracované protokoly k řešeným úkolům podle pokynů přednášejícího.
Last update: Štefánek Michal, Mgr. (31.05.2020)
Syllabus -
The practical course includes lab work (part A), interpretation of the sequencer data and preparing data matrices (part B), data analysis (part C), and basics of next-generation (NGS) data analysis (part D).
A: Lab work - 2 days
A1. DNA sequencing
PCR amplification of the target DNA region (non-coding cpDNA region, ITS…)
agarose gel electrophoresis (test of successful PCR amplification)
cycle sequencing using ABI PRISM BigDye Terminator v3.1 kit
product precipitation
sequencing run at ABI 3100xl Avant (Biological section of the Faculty of Science)
A2. microsatellites
use of specific nuclear primers (PCR reaction)
use of universal chloroplast primers (PCR reaction)
agarose gel electrophoresis (test of successful PCR amplification)
PCR product precipitation, mixing with ROX internal standard
fragment analysis run at ABI 3100xl Avant (Biological section of the Faculty of Science)
A3. NGS library preparation
DNA sonication using Covaris M220, quality check using gel
library preparation using NEBNext Ultra II kit
library quantification using Qubit or LabChip
B: Sequencer data interpretation - 1 day
B1. DNA sequencing
editing of sequences (FinchTV etc.)
automatic alignment using ClustalX and MAFFT
alignment editing, manipulation with sequences - BioEdit, FaBox
B2. microsatellites
data analysis in GeneMarker
interpreting stutter bands, -A addition etc., the building of data matrices
C: Data analysis - 1 day
C1. DNA sequencing
searching for similar sequences in GenBank (BLAST)
basic tree building (FastTree)
indel coding - SeqState
statistic parsimony network - TCS
building data matrices for subsequent analyses (NEXUS, PHYLIP format etc.), format conversion
C2. microsatellites
basic data analyses (MicroSatelliteAnalyser)
AMOVA (Arlequin)...
D: Basic NGS data analysis - 1 day
FASTQ sequences retrieval from short read archive (fastq-dump)
data quality evaluation (FastQC), trimming (Trimmomatic), duplicate removal (fastuniq)
read mapping to the reference (BWA)
analysis of mapped reads (samtools, Tablet)
de-novo assembly of chloroplast genome (Velvet)
automated annotation (web GeSeq)
Last update: Štefánek Michal, Mgr. (31.05.2020)
Praktické cvičení zahrnuje práci v laboratoři (část A), interpretaci dat ze sekvenátoru a přípravu datových matic (část B), vyhodnocování dat (část C) a základní praktikum analýzy next-generation sequencing (NGS) dat (část D).
A: Laboratorní práce - 2 dny
A1. sekvenování DNA
příprava a odladění PCR amplifikace požadovaného úseku DNA (nekódující úseky cpDNA, ITS…)
otestování úspěšnosti amplifikace elektroforézou na agarosovém gelu
přečištění PCR fragmentu pomocí kitu
kvantifikace PCR produktu (změření koncentrace na spektrofotometru)
vlastní sekvenační reakce (cycle sequencing) pomocí kitu ABI PRISM BigDye Terminator v3.1
přečištění produktu, příprava pro analýzu na sekvenátoru
použití automatického sekvenátoru ABI 3130xl Avant na biologické sekci PřF UK
A2. mikrosatelity
použití specifických primerů pro jaderné mikrosatelity (PCR reakce)
použití univerzálních pro chloroplastové mikrosatelity (PCR reakce)
otestování úspěšnosti amplifikace elektroforézou na agarosovém gelu
precipitace PCR produktů, příprava pro analýzu na sekvenátoru
fragmentační analýza na sekvenátoru ABI 3100xl Avant na biologické sekci PřF UK
A3. příprava knihoven pro NGS
sonikace DNA na přístroji Covaris M220, test na gelu
příprava knihovny pomocí kitu NEBNext Ultra II
kvantifikace knihovny na přístroji Qubit nebo LabChip
B: Interpretace dat ze sekvenátoru - 1 den
B1. sekvenování
editace sekvenčních dat (FinchTV aj.) ze sekvenátoru, příprava pro alignment
automatický alignment v programu ClustalX a MAFFT
úprava alignmentu, manipulace se sekvencemi - BioEdit, FaBox
B3. mikrosatelity
jednoduchá analýza získaných dat v programu GeneMarker
vysvětlení problému se stutter bands, -A addition ad., příprava datové matice pro další analýzy
C: Analýza datových matic - 1 den
C1. sekvenování
vyhledávání podobných sekvencí v GenBank (BLAST)
základní tvorby stromů (FastTree)
kodování indelů - SeqState
statistické parsimonické sítě - TCS
příprava datové matice pro další analýzy (NEXUS, PHYLIP formát ad.), konverze mezi formáty
C2. mikrosatelity
základní analýza dat (MicroSatelliteAnalyser)
AMOVA (Arlequin)...
D: základní analýza NGS data - 1 den
získávání FASTQ dat ze short read archive (fastq-dump)
analýza a hodnocení kvality (FastQC), trimming (Trimmomatic), odstranění duplikátů (fastuniq)
