This practical course will demonstrate classical as well as state-of-the-art cytogenetic techniques. The accent is put
on cytogenetic methods beneficial to taxonomic, biosystematic and phylogeographic studies. Students will get
acquainted with preparation of mitotic and meiotic chromosomes, chromosome counting, the course of male
meiosis as well as with principles of light and fluorescence microscopy. Molecular cytogenetic techniques will
include DNA probe labelling, fluorescene in situ hybridization (FISH), genomic in situ hybridization (GISH) and
chromosome painting. Digital processing of captured chromosome images will be shown.
Last update: Kubátová Alena, RNDr., CSc. (12.04.2011)
Praktické cvičení je zaměřeno na demonstraci klasických i nejmodernějších cytogenetických metod, s důrazem na
techniky využitelné v taxonomických, biosystematický a fylogeografických studiích. Absolventi kursu se seznámí s
metodikou přípravy mitotických a meiotických chromozomů, počítáním chromozomů, s průběhem meiosy, stejně
jako s principy světelné a fluorescenční mikroskopie. Další molekulárně cytogenetické techniky zahrnují barvení
DNA sond, fluorescenční in situ hybridizaci (FISH), genomickou in situ hybridizaci (GISH) a chromosome painting.
Absolventi si osvojí fotografickou dokumentaci chromozomových preparátů a jejich následnou digitální úpravu.
Last update: Kubátová Alena, RNDr., CSc. (12.04.2011)
Literature - Czech
Schwarzacher T, Heslop-Harrison P (2000) Practical in situ hybridization. BIOS Scientific Publishers Limited.Oxford. pp.203.
Liehr T (ed.) 2009. Fluorescence in situ hybridization (FISH). Springer-Verlag. Heidelberg. Berlin. pp.451.
Lysak MA, Mandakova T (2012) Analysis of plant meiotic chromosomes by chromosome painting. In Plant Meiosis: Methods and Protocols. Edited by Pawlowski WP, Grelon M. Humana Press. New York. (pp. = jeste neni publikovano)
Last update: Kubátová Alena, RNDr., CSc. (26.04.2012)
Requirements to the exam - Czech
písemný test
Last update: Lysák Martin A., doc. Mgr., Ph.D. (11.01.2012)
Syllabus -
Day 1
introduction
preparation of mitotic chromosomes from root tip meristems (Nicotiana, Festuca ´ Lolium hybrids) and preparation of meiotic chromosome spreads from anthers (Arabidopsis thaliana)
theoretical and practical principles of light and fluorescence microscopy
analysis of chromosome preparations using fluorescence microscopy (selection of suitable slides for Day 2)
direct and indirect labelling of DNA probes (amplification of the Arabidopsis-type telomere repeat by PCR; labelling of ribosomal DNA repeats, chromosome-specific BAC clones, and genomic DNA using nick translation)
Day 2
fluorescence in situ hybridization (FISH), chromosome painting, genomic in situ hybridization (GISH): PART I (slide pretreatment, preparation of hybridization mix, probe denaturation)
stadia of meiosis (meiosis analyzed using phase and fluorescence microscopy, digital microscope photography)
Day 3
FISH, chromosome painting, GISH: PART II (fluorescence detection of hybridized DNA probes)
analysis of microscope preparations using fluorescence microscopy, image capture
computer processing of microscope images (Adobe Photoshop)
conclusions
Last update: Kubátová Alena, RNDr., CSc. (12.04.2011)
Den 1
úvod
příprava mikroskopických preparátů z kořenových meristémů (Nicotiana, hybridní rostliny Festuca ´ Lolium: mitotické chromosomy) a prašníků (Arabidopsis thaliana: meiotické chromosomy)
analýza připravených preparátů pomocí fluorescenčního mikroskopu (výběr vhodných preparátů pro Den 2)
přímé a nepřímé značení DNA sond a jejich kontrola na agarosovém gelu (amplifikace a telomerové repetice A. thaliana pomocí PCR; značení rDNA repetic a chromosomově-specifických BAC klonů A. thaliana pomocí nick translace; značení genomové DNA pomocí nick translace)
Den 2
fluorescenční in situ hybridizace (FISH, chromosome painting)/genomická in situ hybridizace (GISH), část I (příprava mikroskopických preparátů pro FISH, příprava hybridizačních sond, hybridizace)
teoretické a praktické principy fluorescenční mikroskopie, práce s fluorescenčním mikroskopem a příslušným softwarem
studium meiosy (stádia meiosy analyzována na připravených preparátech pomocí fluorescenčního mikroskopu, digitálně fotografická dokumentace)
Den 3
FISH, chromosome painting/GISH, část II (odmytí a detekce nepřímo značených DNA sond)
analýza preparátů pomocí fluorescenčního mikroskopu, digitálně fotografická dokumentace (lokalizace tandemových repetic na chromosomech a v jádrech A. thaliana, chromosome painting: lokalizace BAC klonů A. thaliana na pachytenních chromosomech a v interfásních jádrech - chromosome territories; vyhodnocení výsledků GISH - demonstrace inter-genomových translokací).
zpracování fotografických výstupů
závěr a shrnutí
Last update: Kubátová Alena, RNDr., CSc. (12.04.2011)
