|
|
|
||
|
Basic approach to biotechnology for construction and preparation of selective immunochemical diagnostics for human health parameters, environment, and food screening, source of synthetical and natural antigens and haptens, their modifying for imunization, preparing of hyperimune sera and monoclonal antibodies and their modifying for diagnostics and immunotherapeutics, basic methods of antigens and antibodies purification, quantification and characterization, purification controlling, clean laboratories, strategy of hybridoma
Last update: VACKOVA (02.05.2002)
|
|
||
|
Harlow, E., Lane, D. : Using Antibodies, 1999 Gosling J.P.: Immunoassays: A Practical Approach, 2000 Last update: VACKOVA (05.05.2005)
|
|
||
|
Historický průřez akcelerace základních molekulárnch a technických poznatků. Antigeny a protilátky, jejich vlastnosti a výčet, metody kvantifikace antigenů a protilátek, solubilizace nerozpustných antigenů, struktura globulinůPolyvalentní globuliny (antiséra) a monoklonální protilátky (MP), rozdíly a specifita reakcí, Antiidiotypové a heterofilní protilátky, HAMA, aviární globuliny- jejich vlastnosti, specifita, Globuliny jako produkt imunizace, imunogenita, hapteny, antigenní determinanta, dynamika tvorby protilátek, zdroje antigenů, parametry čistoty, modulace slabých a silných imunogenůPAGE jako zdroj čistých antigenů (lokalizace a možnosti imunizační aplikace - barvení, gelové fragmenty, homogenizace při nízkých teplotách nebo lyofilizací, elektroeluce a jiné transfery, acetonové sušiny Syntetické antigeny, velikost a složení, volba nosiče, konjugace Izolace bakteriálních antigenů a jejich solubilizace, imunní komplexy a modifikované antigeny jako imunogen Výběr laboratorních donorů - druh, kmen, počet Adjuvans IFA, CFA,hydrogely a další preparáty Dávkování a aplikační režim, forma antigenu, aplikační cesta (s.c., i.d., i.m., i.p., i.v., intraorgánové aplikace , imunizace pro konstrukci hybridomů in vivo a in vitro), booster Získávání kontrolních odběrů, semikvantitativní metody pro stanovení dynamiky tvorby protilátek, odkrvení donora pro hyperimunní preparát- dynamika hladiny antigenu, imunních komplexů a protilátek, exsangvinace. Zisk polyvalentních protilátek indukcí acsitických tekutin užitím Freundova adjuvans nebo myelomových buněk. Imunizace, příprava a vlastnosti aviárních globulinů (IgY ) Typy imunoenzymatických reakcí, příprava složek, stanovení koncepce konstrukce diagnostických souprav pro zdravotnické, veterinární, farmaceutické a potravinářské detekce.Základní protokol imunoesejí pro přímou kvantifikaci antigenů nebo protilátek, kotvené systémy v přebytku antigenu/protilátky, kompetitivní testy, sendvičové metody, magnetické a nemagnetické partikule, filtrační testy . Základní metody značení radioaktivními izotopy (I,Cr,Tc) a enzymy (PX,ALP), fluorochromy (FITC) systém avidin (streptavidin)- biotin a PAP jako amplifikační systémy. Substrátové barvení pro bloting, imunohistochemické metody a ELISA (CELISA), využití bakteriálních receptorů v imunoenzymatických testech. Produkce monoklonálních protilátek (MP), rozvaha základní strategie (dle povahy antigenu a aplikačního účelu MP) této technologie Jednotlivé fáze konstrukce a produkce: výběr kmene lab. donorů, formy antigenu a způsobu imunizace pro zisk imunocytů (blokování biologicky účinných látek), způsob aplikace, adjuvans, implantáty, in vitro imunizace. Testování účinnosti imunizace, zisk séra pro skríning, výběr imunocytů. Vývoj skríningovýchmetod, základní strategie, imobilizace antigenu pro přímé a nepřímé sendvičové testy (NC a PVC nosiče, precipitace, fixace buněk) event. funkční testy. Konstrukce hybridomů- preparace pro fúze (výživové vrstvy, suplementace, kvantifikace buněk morfologické a funkční, fetální , prekolostrální nebo modifikovaná a plná séra, příprava fúzogenů a médií selekčních médií, preparace a synchronizace rodičovských linií pro fúze (HPRT mutace), selekce a klonace (limitní ředění, vypichování kolonií, tekutá a semisolidní prostředí, funkční detekce v agaru), propagace a zamražení pozitivních klonů, nestabilní linie, reklonace, kontaminace ve stádiu selekce a klonace. Stanovení charakteristik hybridomů a produkovaných MP (pro účely registrace a uložení v bance). Počet chromozómů, růstové a produkční charakteristiky, stanovení tříd a podtříd globulinu (princip na NC, přímá ELISA, sendvičový test při limitních hladinách MP) interakce s antigenem, ověření produkce jediného Ig, izoelektrický bod (fokusace jako separační a analytická metoda), reakce s biologicky účinnými látkami a bakteriálními receptory, limitovaná proteolýza pro identifikaci MP, SDS-PAGE jako kontrola globulinové molekuly. Propagace hybridomů a myelomů pasážováním, počet buněk a životnost, dlouhodobé uchovávání inokul, zmražení a rozmražení. Kontaminace bakteriemi, plísněmi a mykoplasmaty, testování a léčba pasážováním in vivo a in vitro za přítomnosti buněk a farmak. Produkce MP in vivo (iritace a odběr ascitických tekutin) a in vitro (stacionární a agitovaná - typy fermentorů a stacionárních kultivátorů), prevalence kontaminantů. Uchovávání ascitů, kultivačních supernatantů, čistých MP a hyperimunních polyvalentních sér (izolovaných frakcí). Metody pro výrobu komerčních preparátů MP a globulinových frakcí a jejich čistota : Metody zahušťování a předčištění, snížení hladiny iritans a lipidů, precipitace sulfáty, čištění kys. kaprylovou, rivanolem a vsádkově za využití DEAE ligandu. Chromatografické čištění -DEAE, hydroxylapatit a gelová molekulová síta, afinitní chromatografie na nosičích s imobilizovaným antigenem, antiglobulinem, proteinem A nebo G, IMAC, perfúzní chromatografie. Velkokapacitní výroba pro diagnostické a farmaceutické účely a její problémy, vliv příměsí na diagnostické a léčebné aplikace. Farmakologicky čisté MP a jejich testování, čisté prostory a jejich navrhování, zabezpečení intaktnosti laminárního proudění, tok materiálu a personální propusti, chování v čistých prostorách, detekce a dokumentace pro deklaraci prostor. Farmaceuticky čisté MP pro přípravu scintigrafik, jejich testování in vitro a in vivo.Chimérické a bispecifické MP, využití a příprava fragmentů MP a polyvalentních Ig, snížení imunogenicity MP, humanizované protilátky, stabilizace protilátek vazbou s organickými stabilizátory a biologicky účinnými látkami. Speciální čištění protilátek pro biosenzorické čipy, řízená imobilizace, vícevrstevné struktury, provázání s biologicky účinnými látkami a blokátory ke snížení nespecifického signálu. Praktikum: ELISA stanovení typu a izotypu neznámé MP Stanovení proporce lidské a zvířecí složky řetězců chimérické protilátky Chequer-board stanovení koncentrace monoklonální vazebné protilátky a konjugátu pro danou koncentraci antigenu (křížová titrace pro sendvičovou metodu). Last update: VACKOVA (05.05.2005)
|