Bude upřesněno, podrobnější informace (e-mail) Petr.Jezek@fgu.cas.cz a Hana.Engstova@fgu.cas.cz
References
[1] S.J. Sahl, S.W. Hell, S. Jakobs, Fluorescence nanoscopy in cell biology, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2018, 18 (11), 685–701.
[2] Dlasková A, Engstová H, et al., Ježek P. 3D super-resolution microscopy reflects mitochondrial cristae alternations and mtDNA nucleoid size and distribution. Biochim Biophys Acta. 2018; 1859 (9), 829-844.
[3] Alán L, Špaček T, Ježek P. Delaunay algorithm and principal component analysis for 3D visualization of mitochondrial DNA nucleoids by Biplane FPALM/dSTORM. Eur Biophys J. 2016, 45 (5), 443-61.
Preliminary scope of work
3D nanoskopie dosud nebyla s to postihnout morfologii mitochondriálních krist a nukleoidů (proteinových komplexů s mtDNA). Vyvineme proto nové metodiky 3D superrezoluční mikroskopie na prototypu 3D mikroskopu firmy Vutara (dnes součást firmy Bruker) pro stochastickou mikroskopii PALM a dSTORM s rozlišením xy 25 nm a z 50 nm. Zavedeme nové typy analýz 3D obrazu reflektující nm změny v morfologii krist a 3D-redistribuci proteinů ovlivňujících mitochondriální kristy za normálních či patologických stavů (diabetes). Pro analýzu 3D obrazů vyvineme nové postupy založené na využití Ripleyho K-funkce a Delaunay algoritmu
Rozvineme také 3D imunocytochemii typu dSTORM s tzv. nanobodies a FRETem excitovaný PALM/dSTORM. Zahájíme tak novou generaci superrezoluční 3D mikroskopie. Analogicky prostudujeme nukleoidy mitochondriální DNA (mtDNA) při zvýšené či snížené biogenezi (fyziologické, patologické), při jejich dělení zejména vlastní metodou mitoFISH nanoskopie pro počítání tzv. D-loops (počátků replikace mtDNA). Uměle nastavíme velikost nukleoidů či jejich obsah mtDNA. Využijeme též STED mikroskopie. Získáme tak nové protokoly pro 3D nanoskopii a zkombinujeme molekulární biologii a fyziologii buňky s nejmodernější 3D superrezoluční mikroskopií. Molekulární biologii zajistí pracovníci odd. 75 FgÚ AV ČR, v.v.i.
Preliminary scope of work in English
3D nanoscopy has not yet assessed mitochondrial cristae morphology, nor the internal structure of mitochondrial DNA (mtDNA) & protein complexes, termed nucleoids. Hence, we’ll survey 3D-redistribution of cristae and their shaping proteins or nucleois employing our prototype Vutara 3D superresolution microscope for stochastic techniques such a PALM and dSTORM. Currently, such an apparatus is offered by Bruker as the commercial microcope with the highest resolution available on the market. We will conduct studies under physiological situations (insulin secretion, hypoxic adaptation, starvation, metabolic-switches) vs. pathology (type-2 diabetes, cancer) using dSTORM with nanobodies or FRET excited PALM/dSTORM. Thus nm changes will be reflected by novel 3D nanoscopy methods. Also mtDNA nucleoids will be studied at increased (physiological) and diminished (pathological) mitochondrial biogenesis, while applying own mitoFISH nanoscopy for D-loop counting. Artificial manipulations of nucleoid size and mtDNA content will be studied as well as nucleoid division. STED microscopy will confirm the expected word priority results. Results will be translated into specific protocols for 3D nanoscopy, specifically developing novel relevant 3D image analyses based upon the Ripley’s K-function and Delaunay algorithm. Molecular cell biology will thus be combined with up-to-date 3D nanoscopy. Note, the molecular biology techniques will be conducted and be ready for the applicants by the coworkers of the Department No.75.
