Implementing modern species delimitation techniques into fungal taxonomy: Aspergillus charting the course

• Thesis title in Czech: Zavedení moderních metod delimitace druhů do taxonomie hub: Aspergillus udává směr
• Thesis title in English: Implementing modern species delimitation techniques into fungal taxonomy: Aspergillus charting the course
• Key words: druhový koncept, vymezení druhů pomocí multilokusových dat, biotechnologie, fylogeneze, diverzita, nové druhy, evoluce, pohlavní stádium, sekce Restricti, sekce Aspergillus, odolnost k stresu, fyziologie
• English key words: species concept, multilocus species delimitation, biotechnologie, fylogeneze, diverzita, new species, evolution, sexual state, Restricti section, Aspergillus section, stres tolerance, physiology
• Academic year of topic announcement: 2016/2017
• Thesis type: dissertation
• Thesis language: angličtina
• Department: Department of Botany (31-120)
• Supervisor: MUDr. Mgr. Vít Hubka, Ph.D.
• Author: hidden - assigned by the advisor
• Date of registration: 21.10.2016
• Date of assignment: 21.10.2016
• Date of electronic submission: 27.10.2023
• Date of proceeded defence: 18.12.2023
• Opponents: Danny Haelewaters, Ph.D.
• Advisors: Mgr. Miroslav Kolařík, Ph.D.

Preliminary scope of work

Taxonomická revize
V rámci své dizertační práce bych rád navázal na svou diplomovou práci zabývající se taxonomií osmofilní sekce Restricti rodu Aspergillus. Ekonomický význam osmofilních zástupců rodu Aspergillus spočívá především ve znehodnocování potravin, krmiva a osiva (Pitt et Hocking 2009). Z klinického hlediska se jedná o málo běžné patogeny s významným alergenním potenciálem, které se zřejmě zásadní měrou podílejí i na vzniku tzv. „syndromu nemocných budov“ (sick-building syndrome) (Saijo et al. 2011).
V prvním roce bude dokončena taxonomická revize celého podrodu Aspergillus, která byla započata v diplomové práci. K souboru izolátů analyzovaných v rámci diplomové práce budou přidány další izoláty ze sekce Restricti a také ze sekce Aspergillus (dříve Eurotium) pocházející zejména z prostředí budov v USA. Druhové hranice budou nalezeny stále více používanými molekulárně fylogenetickými metodami, založenými na modelu koalescence (Carstens et al. 2013) a podpořeny fenotypovými znaky. Kromě analýzy morfologie (včetně skenovací elektronové mikroskopie) a osmotolerance (schopnost růstu v osmotickém gradientu), bude metodika rozšířena o analýzu spektra sekundárních metabolitů (Frisvad 2015), která bude provedena ve spolupráci s dánskou skupinou (J. C. Frisvad, Technical University of Denmark). Na celém projektu spolupracují i další zahraniční instituce, především CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre v Utrechtu, United States Department of Agriculture v Peoria (USA), aj.
Indukce pohlavního stadia a biologický druhový koncept
Po dokončení taxonomické části práce bude určeno pohlavní ladění izolátů ze sekce Restricti osekvenováním lokusů MAT faktoru. Všechny druhy v sekci Aspergillus jsou homothalické (v genotypu každého kmenu jsou obsaženy oba párovací typy, k tvorbě pohlavního stadia stačí jeden kmen), zatímco v sekci Restricti nebylo dosud s výjimkou homothalického druhu Aspergillus halophilicus pohlavní stadium pozorováno. Poměrně velká vnitrodruhová diverzita v sekci Restricti naznačuje, že se s největší pravděpodobností jedná o druhy heterothalické. V jiných sekcích rodu Aspergillus byla obdobným způsobenm úspěšně indukována tvorba pohlavního stadia po zkřížení izolátů druhů, které byly do té doby považovány za striktně asexuální (O'Gorman et al. 2009).
Po zjištění pohlavního ladění izolátů bude provedena série křížících pokusů mezi izoláty s opačnými párovacími typy s cílem indukovat tvorbu pohlavního stadia. Bude zkoumána schopnost druhů tvořit vnitrodruhové i mezidruhové hybridy a životaschopnost vzniklých hybridů s využitím průtokové cytometrie (Bradner et Nevalainen 2003). Výsledkem bude srovnání fylogenetického a biologického druhového konceptu v této sekci.
Analýza strestolerance, transkriptomika
V další fázi bude testováno předpokládané snížení fittness případných mezidruhových kříženců vzhledem k vnitrodruhovým křížencům srovnáním klíčivosti askospor a konidií při stresových podmínkách (různá teplota a vodní aktivita substrátu). Dále bude s využitím NGS (Next-Generation Sequencing) metody RNA-Seq (Wang et al. 2009) zkoumán mechanismus osmotolerance u rodu Aspergillus. Bude provedeno srovnání transkriptomu osmofilního druhu z podrodu Aspergillus a jiného druhu rodu Aspergillus s nízkou osmotolerancí kultivovaných při vysoké a nízké vodní aktivitě substrátu. V případě úspěšného mezidruhového křížení bude také zkoumán transkriptom mezidruhových kříženců a rodičovských druhů. Metoda RNA-Seq je vhodná ke studiu rodu Aspergillus díky rozsáhlé databázi Aspergillus Genome Database (Cerqueira et al. 2014), která umožní anotaci velké části získaných transkriptomů. Výsledky přinesou vhled do mechanismu osmotolerance u rodu Aspergillus a vlivu mezidruhového křížení na mikro i makroevoluci.
Citovaná literatura
Bradner JR, Nevalainen KMH (2003). Metabolic activity in filamentous fungi can be analysed by flow cytometry. J Microbiol Meth54: 193-201.
Carstens BC, Pelletier TA, Reid NM, Satler JD (2013). How to fail at species delimitation. Molecular Ecology22: 4369-4383.
Cerqueira GC, Arnaud MB, Inglis DO, Skrzypek MS, Binkley G, Simison M, Miyasato SR, Binkley J, Orvis J, Shah P, Wymore F, Sherlock G, Wortman JR (2014). The Aspergillus Genome Database: multispecies curation and incorporation of RNA-Seq data to improve structural gene annotations. Nucleic Acids Research42: D705-D710.
Frisvad JC (2015). Taxonomy, chemodiversity, and chemoconsistency of Aspergillus, Penicillium, and Talaromyces species. Frontiers in Microbiology5: 7.
O'Gorman CM, Fuller HT, Dyer PS (2009). Discovery of a sexual cycle in the opportunistic fungal pathogen Aspergillus fumigatus. Nature457: 471-475.
Pitt JI, Hocking AD (2009). Fungi and food spoilage, Springer.
Saijo Y, Kanazawa A, Araki A, Morimoto K, Nakayama K, Takigawa T, Tanaka M, Shibata E, Yoshimura T, Chikara H, Kishi R (2011). Relationships between mite allergen levels, mold concentrations, and sick building syndrome symptoms in newly built dwellings in Japan. Indoor Air21: 253-263.
Wang Z, Gerstein M, Snyder M (2009). RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics10: 57-63.

Preliminary scope of work in English

Taxonomic revision of the section Restricti and Aspergillus (formerly Eurotium) using multilocus sequence data, genome sizes (estimated using flow cytometry) physiology (inc. secondary metabolite identification) and morphology. The advance statistic methods will be used for the species boundaries assessing. The mating experiments will be conducted in order to stimulate sexual state formation. The fitness and other biological features of interspecies hybrids will be studied standard and genomic approaches.