Vyšetření rekombinací mezi genem a pseudogenem pro β-glukocerebrosidasu vedoucích ke vzniku patogenních alel

• Thesis title in Czech: Vyšetření rekombinací mezi genem a pseudogenem pro β-glukocerebrosidasu vedoucích ke vzniku patogenních alel
• Thesis title in English: Detection of β-glucocerebrosidase gene/pseudogene recombination events leading to pathogenic alleles
• Key words: genová konverze, gen pro β-glukocerebrosidasu, pseudogen pro β glukocerebrosidasu, sekvenování nové generace, bodová mutace
• English key words: gene conversion, β-glucocerebrosidase gene, β-glucocerebrosidase pseudogene, next-generation sequencing, point mutation
• Academic year of topic announcement: 2015/2016
• Thesis type: diploma thesis
• Thesis language: čeština
• Department: Department of Genetics and Microbiology (31-140)
• Supervisor: MUDr. Martin Hřebíček, Ph.D.
• Author: hidden - assigned by the advisor
• Date of registration: 27.11.2015
• Date of assignment: 17.12.2015
• Date of electronic submission: 02.05.2017
• Date of proceeded defence: 08.06.2017
• Opponents: RNDr. Michaela Schierová, Ph.D.

Preliminary scope of work

Cílem této diplomové práce bylo vypracovat přehled o genové konverzi, její roli v patogenezi lidských onemocnění a zhodnotit využití metod založených na sekvenování nové generace (NGS) pro detekci vzácných změn sekvence DNA. Jedná se o pilotní studii využití NGS pro detekci bodových mutací vznikajících de novo v genu pro β-glukocerebrosidasu genovou konverzí mezi ním a jeho pseudogenem v meiotických a mitotických buňkách kontrolních osob. Primery specifické pro aktivní gen byly použity pro selektivní amplifikaci úseku devátého a desátého exonu genu, kde se „rekombinantní“ změny vyskytují nejčastěji. Byla využita metoda značení cílových molekul DNA pomocí náhodných sekvencí v primeru.
Bioinformatickým zpracováním byly detekovány bodové mutace v sekvencích získaných z 20 vzorků genomové DNA na platformě Illumina MiSeq. Sekvence byly filtrovány, tříděny podle unikátního značení jednotlivých molekul DNA a byly vytvořeny alignmenty těchto sekvencí. Softwarovou detekcí se záměrně nestriktními kritérii bylo v jednotlivých vzorcích nalezeno 12-48 potenciálních bodových mutací, které byly následně ověřovány přehodnocením alignmentů sekvencí nesoucích shodnou značící sekvenci. Počet alignmentů s unikátním značením byl v rozmezí 7-15 tisíc na vzorek. Ve třech vzorcích byly nalezeny v genu pro β-glukocerebrosidasu mutace potenciálně vzniklé genovou konverzí, což svědčí pro nižší frekvenci, než jaká byla detekována staršími metodami. Analýza značících sekvencí v primeru naznačuje možné způsoby zlepšení citlivosti metody.
Dalším cílem bylo testování metod přípravy templátu pro NGS pomocí obohacování konvertovaných sekvencí. Jednalo se o metodu založenou na principu zámkových sond, mutačně specifického PCR a izotermické amplifikace zprostředkované smyčkou. Při aplikaci na lidskou genomovou DNA tyto metody však nevedly k získání dostatečného množství kvalitního templátu pro NGS.

Preliminary scope of work in English

This diploma thesis provides an overview of gene conversion, its role in the pathogenesis of human diseases and the use of methods based on next-generation sequencing (NGS) for detection rare variants of DNA sequence. Labeling of target DNA molecules by random nucleotides in primer and NGS were used for detection point mutations arising de novo in the β-glucocerebrosidase gene by gene conversion between it and its pseudogene in meiotic and mitotic cells of control subjects. Primers specific for the active gene were used to selectively amplify the ninth and tenth exon of the gene where “recombinant” variants occur most frequently.
Sequences generated from 20 genomic DNA samples on Illumina MiSeq platform were quality filtered, sorted by unique labels and consensus sequences were created from alignments of sequences carrying the same DNA tag. The number of potential point mutations in the samples ranged between 12 and 48. The mutations were manually re-evaluated from the alignments. The number of alignments with unique labeling was in the range of 7-15 thousand per sample. Only three samples carried possible recombinant mutations, suggesting a lower frequency of conversion in the region than reported by other techniques. Analysis of unique sequences in primer indicated possible ways to improve the sensitivity of the method.
Another goal was to test methods of preparing the template for NGS by enriching the converted sequences. Methods based on padlock probes, mutational-specific PCR and loop-mediated isothermal amplification yield sufficient amounts of good quality template for NGS.