One Health approach to understand emerging zoonotic pathogens in the Trichophyton benhamiae complex

• Thesis title in Czech: Komplexní přístup k pochopení nových zoonotických patogenů z komplexu Trichophyton benhamiae
• Thesis title in English: One Health approach to understand emerging zoonotic pathogens in the Trichophyton benhamiae complex
• Key words: citlivost k antimykotikům, klonalita, dermatofytózy, diverzita, epidemiologie, houboví patogeni, populační genetika, taxonomie, Trichophyton, zoonotické infekce, zoofilní dermatofyty
• English key words: antifungal susceptibility, clonality, dermatophytosis, diversity, epidemiology, fungal pathogens, population genetics, taxonomy, Trichophyton, zoonotic infections, zoophilic dermatophytes
• Academic year of topic announcement: 2015/2016
• Thesis type: dissertation
• Thesis language: angličtina
• Department: Department of Botany (31-120)
• Supervisor: MUDr. Mgr. Vít Hubka, Ph.D.
• Author: hidden - assigned by the advisor
• Date of registration: 07.10.2015
• Date of assignment: 07.10.2015
• Date of electronic submission: 22.10.2023
• Date of proceeded defence: 17.01.2024
• Opponents: doc. RNDr. Vladimír Buchta, CSc.

Preliminary scope of work

1. Epidemiologická část
Epidemiologická část práce bude hodnotit spektrum původců dermatofytóz na území České republiky. Podkladem práce budou klinické izoláty a data shromážděná během několikaleté soustavné studie dermatofytóz v ČR, do které je zapojeno celkem 8 klinických pracovišť. Výsledkem přinesou jednak přehled všech hlavních původce dermatofytóz v ČR a jejich incidenci v české populaci. Díky identifikaci izolátů molekulárními metodami budou odhaleny kryptické a nepopsané druhů, a také identifikovány izoláty s atypickým fenotypem, který se u dermatofytů běžně vyskytují v souvislosti s léčbou předcházející izolaci původce. Dlouhodobá a pozorování umožní identifikovat hlavní rizikové faktory spojené s infekcemi způsobenými jednotlivými druhy, sezónní a regionální variabilitu v druhových spektrech. Shromážděné anamnestické údaj k případům budou použity pro zlepšení diagnostiky a prevence dermatofytóz. Anamnestická a epidemiologická data, a údaje o úspěchu léčby shromážděné v rámci tohoto projektu budou využity pro zlepšení empirické terapie.
Další část práce se bude věnovat monitoringu epidemiologie mykotických infekcí působených některými druhy dermatofytů molekulárně genetickými metodami. Zvláštní pozornost bude věnována infekcím způsobeným druhem Arthroderma benhamiae, který byl ještě před několika lety naprosto nevýznamný, ale v současnosti působí epidemii infekcí ve střední Evropě. Tato epidemie je díky probíhající studii nejlépe zdokumentována právě v ČR (stovky případů s detailními údaji o klinickém obrazu a léčbě) a schéma založené na molekulárně genetických metodách (mikrosatelity, typizace sekvenováním několika genetických lokusů) pro účely monitoringu šíření infekce bylo předmětem diplomové práce studentky. Přínosem tohoto schématu bylo i zjištění, že většinu infekcí působí jediný genetický klon, který se odštěpil od běžné populace této zoofilní houby, která jinak napadá především hlodavce (morčata, činčily, apod.), a na člověka se v minulosti téměř nepřenášela. Další výzkum by měl specifikovat faktory virulence tohoto výjimečného klonu, což by významně přispělo k poznání o patogenezi povrchových mykóz (viz níže). Díky zahraniční spolupráci se pro typizaci podařilo získat izoláty z mnoha dalších evropských zemí (Německo, Belgie, Švýcarsko, Itálie, aj.), ale také z Japonska a USA. Zařazení těchto izolátů by mělo ozřejmit, jestli existuje vztah mezi zastoupením genotypů v závislosti na geografickém původu izolátů. Typizace se bude týkat i dalších druhů dermatofytů, např. T. verrucosum, který je původcem profesionálních nákaz u pracovníků se skotem.

2. Taxonomická část
Cílem je vytvoření popisu nových druhů zachycených v epidemiologické studii. Druhy budou popsány pomocí polyfázického přístupu zahrnujícího sekvence DNA z několika lokusů (ITS a LSU rDNA, gen pro β-tubulin, aktin a RNA polymerázu II), mikro- a makromorfologii a fyziologii.
Vytvořit novou příručka pro identifikaci klinicky významných dermatofytů vyskytujících se v Evropě (cca 20-25 druhů). Jednotlivé druhy budou reprezentovány izoláty identifikovanými molekulárními metodami (získané během tohoto projektu i ze zahraničních sbírek kultur hub) a charakterizovány pomocí makromorfologie (růst na standardních médiích), mikromorfologie, růstu v teplotním gradientu (obr. 3 a 4), standardními fyziologickými a biochemickými testy (T1-T7 média, ureázový test, test perforace vlasu, apod.).
Pohlavní stádium dermatofyt - navození tvorby pohlavního stádia za různých podmínek (přístup vzduchu, světelné podmínky, kultivační media, přítomnost jiného mikroorganismu, vysychání, zavodnění, přítomnost keratinu získaného z různých zdrojů).

3. Faktory virulence
Sekundární metabolity
Sekundární metabolity jsou spolu s proteolytickými enzymy považovány za hlavní faktory virulence u dermatofytů. Problematika sekundárních metabolitů u této skupiny dosud nebyla intenzivně studována, přestože se ukazuje, že dermatofyty produkují široké spektrum metabolitů zatím neznámé povahy (Achterman & White 2013,Burmester et al 2011,Gupta et al 2000,Tainwala & Sharma 2011,Weitzman & Summerbell 1995). U jednoho z doposud nalezených metabolitů byly prokázány silně toxické účinky (Gupta et al 2000) a u dalších látek zatím neznámé struktury byly pozorovány antibiotické schopnosti (Hammadi et al 2007). Otázkou tedy zůstává jaký je vliv těchto metabolitů na tkáně hostitele.
Analýza sekundárních metabolitů u vybraných kmenů bude provedena pomocí rozpouštědlové extrakce a extrakce na pevné fázi metodou vysoko účinné kapalinové chromatografie (HPLC) případně metodou extrémně účinné kapalinové chromatografie (UPLC) s následnou detekcí na UV detektoru. Vlastní struktura látek bude zjišťována metodou hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením (HRMS) a spektroskopie nukleární magnetické resonance (NMR). U některých z takto nalezených metabolitů proběhne vyšetření na možnou biologickou aktivitu. Zjišťována bude také produkce těchto látek v tkáni hostitele.
Výzkum bude realizován v mikrobiologickém ústavu AVČR.

Časový harmonogram projektu:
1. rok: sběr dat
2. rok: sběr a analýza dat
3. rok: sběr a analýza dat, příprava rukopisů
4. rok: závěrečné analýzy dat, příprava rukopisů, odevzdaní doktorského projektu
PODPORA:GAUK 8615 (od r. 2015)

Achterman RR, White TC. 2013. Dermatophytes. Current Biology 23: 551-2
Burmester A, Shelest E, Glockner G, Heddergott C, Schindler S, et al. 2011. Comparative and functional genomics provide insights into the pathogenicity of dermatophytic fungi. Genome Biol 12: R7
Gupta AK, Ahmad I, Borst I, Summerbell RC. 2000. Detection of xanthomegnin in epidermal materials infected with Trichophyton rubrum. Journal of investigative dermatology 115: 901-5
Hammadi D, Selselet G, Bensoultane S. 2007. Antibiotic like-substances produced by some trichophytic dermatophytes. African Journal of Biotechnology 6: 1788-90
Tainwala R, Sharma Y. 2011. Pathogenesis of dermatophytoses. Indian journal of dermatology 56: 259-61
Weitzman I, Summerbell RC. 1995. The dermatophytes. Clinical microbiology reviews 8: 240-59
1. Epidemiologická část
Epidemiologická část práce bude hodnotit spektrum původců dermatofytóz na území České republiky. Podkladem práce budou klinické izoláty a data shromážděná během několikaleté soustavné studie dermatofytóz v ČR, do které je zapojeno celkem 8 klinických pracovišť. Výsledkem přinesou jednak přehled všech hlavních původce dermatofytóz v ČR a jejich incidenci v české populaci. Díky identifikaci izolátů molekulárními metodami budou odhaleny kryptické a nepopsané druhů, a také identifikovány izoláty s atypickým fenotypem, který se u dermatofytů běžně vyskytují v souvislosti s léčbou předcházející izolaci původce. Dlouhodobá a pozorování umožní identifikovat hlavní rizikové faktory spojené s infekcemi způsobenými jednotlivými druhy, sezónní a regionální variabilitu v druhových spektrech. Shromážděné anamnestické údaj k případům budou použity pro zlepšení diagnostiky a prevence dermatofytóz. Anamnestická a epidemiologická data, a údaje o úspěchu léčby shromážděné v rámci tohoto projektu budou využity pro zlepšení empirické terapie.
Další část práce se bude věnovat monitoringu epidemiologie mykotických infekcí působených některými druhy dermatofytů molekulárně genetickými metodami. Zvláštní pozornost bude věnována infekcím způsobeným druhem Arthroderma benhamiae, který byl ještě před několika lety naprosto nevýznamný, ale v současnosti působí epidemii infekcí ve střední Evropě. Tato epidemie je díky probíhající studii nejlépe zdokumentována právě v ČR (stovky případů s detailními údaji o klinickém obrazu a léčbě) a schéma založené na molekulárně genetických metodách (mikrosatelity, typizace sekvenováním několika genetických lokusů) pro účely monitoringu šíření infekce bylo předmětem diplomové práce studentky. Přínosem tohoto schématu bylo i zjištění, že většinu infekcí působí jediný genetický klon, který se odštěpil od běžné populace této zoofilní houby, která jinak napadá především hlodavce (morčata, činčily, apod.), a na člověka se v minulosti téměř nepřenášela. Další výzkum by měl specifikovat faktory virulence tohoto výjimečného klonu, což by významně přispělo k poznání o patogenezi povrchových mykóz (viz níže). Díky zahraniční spolupráci se pro typizaci podařilo získat izoláty z mnoha dalších evropských zemí (Německo, Belgie, Švýcarsko, Itálie, aj.), ale také z Japonska a USA. Zařazení těchto izolátů by mělo ozřejmit, jestli existuje vztah mezi zastoupením genotypů v závislosti na geografickém původu izolátů. Typizace se bude týkat i dalších druhů dermatofytů, např. T. verrucosum, který je původcem profesionálních nákaz u pracovníků se skotem.

2. Taxonomická část
Cílem je vytvoření popisu nových druhů zachycených v epidemiologické studii. Druhy budou popsány pomocí polyfázického přístupu zahrnujícího sekvence DNA z několika lokusů (ITS a LSU rDNA, gen pro β-tubulin, aktin a RNA polymerázu II), mikro- a makromorfologii a fyziologii.
Vytvořit novou příručka pro identifikaci klinicky významných dermatofytů vyskytujících se v Evropě (cca 20-25 druhů). Jednotlivé druhy budou reprezentovány izoláty identifikovanými molekulárními metodami (získané během tohoto projektu i ze zahraničních sbírek kultur hub) a charakterizovány pomocí makromorfologie (růst na standardních médiích), mikromorfologie, růstu v teplotním gradientu (obr. 3 a 4), standardními fyziologickými a biochemickými testy (T1-T7 média, ureázový test, test perforace vlasu, apod.).
Pohlavní stádium dermatofyt - navození tvorby pohlavního stádia za různých podmínek (přístup vzduchu, světelné podmínky, kultivační media, přítomnost jiného mikroorganismu, vysychání, zavodnění, přítomnost keratinu získaného z různých zdrojů).

3. Faktory virulence
Sekundární metabolity
Sekundární metabolity jsou spolu s proteolytickými enzymy považovány za hlavní faktory virulence u dermatofytů. Problematika sekundárních metabolitů u této skupiny dosud nebyla intenzivně studována, přestože se ukazuje, že dermatofyty produkují široké spektrum metabolitů zatím neznámé povahy (Achterman & White 2013,Burmester et al 2011,Gupta et al 2000,Tainwala & Sharma 2011,Weitzman & Summerbell 1995). U jednoho z doposud nalezených metabolitů byly prokázány silně toxické účinky (Gupta et al 2000) a u dalších látek zatím neznámé struktury byly pozorovány antibiotické schopnosti (Hammadi et al 2007). Otázkou tedy zůstává jaký je vliv těchto metabolitů na tkáně hostitele.
Analýza sekundárních metabolitů u vybraných kmenů bude provedena pomocí rozpouštědlové extrakce a extrakce na pevné fázi metodou vysoko účinné kapalinové chromatografie (HPLC) případně metodou extrémně účinné kapalinové chromatografie (UPLC) s následnou detekcí na UV detektoru. Vlastní struktura látek bude zjišťována metodou hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením (HRMS) a spektroskopie nukleární magnetické resonance (NMR). U některých z takto nalezených metabolitů proběhne vyšetření na možnou biologickou aktivitu. Zjišťována bude také produkce těchto látek v tkáni hostitele.
Výzkum bude realizován v mikrobiologickém ústavu AVČR.

Časový harmonogram projektu:
1. rok: sběr dat
2. rok: sběr a analýza dat
3. rok: sběr a analýza dat, příprava rukopisů
4. rok: závěrečné analýzy dat, příprava rukopisů, odevzdaní doktorského projektu
PODPORA:GAUK 8615 (od r. 2015)

Achterman RR, White TC. 2013. Dermatophytes. Current Biology 23: 551-2
Burmester A, Shelest E, Glockner G, Heddergott C, Schindler S, et al. 2011. Comparative and functional genomics provide insights into the pathogenicity of dermatophytic fungi. Genome Biol 12: R7
Gupta AK, Ahmad I, Borst I, Summerbell RC. 2000. Detection of xanthomegnin in epidermal materials infected with Trichophyton rubrum. Journal of investigative dermatology 115: 901-5
Hammadi D, Selselet G, Bensoultane S. 2007. Antibiotic like-substances produced by some trichophytic dermatophytes. African Journal of Biotechnology 6: 1788-90
Tainwala R, Sharma Y. 2011. Pathogenesis of dermatophytoses. Indian journal of dermatology 56: 259-61
Weitzman I, Summerbell RC. 1995. The dermatophytes. Clinical microbiology reviews 8: 240-59

Preliminary scope of work in English

1. Epidemiologická část
Epidemiologická část práce bude hodnotit spektrum původců dermatofytóz na území České republiky. Podkladem práce budou klinické izoláty a data shromážděná během několikaleté soustavné studie dermatofytóz v ČR, do které je zapojeno celkem 8 klinických pracovišť. Výsledkem přinesou jednak přehled všech hlavních původce dermatofytóz v ČR a jejich incidenci v české populaci. Díky identifikaci izolátů molekulárními metodami budou odhaleny kryptické a nepopsané druhů, a také identifikovány izoláty s atypickým fenotypem, který se u dermatofytů běžně vyskytují v souvislosti s léčbou předcházející izolaci původce. Dlouhodobá a pozorování umožní identifikovat hlavní rizikové faktory spojené s infekcemi způsobenými jednotlivými druhy, sezónní a regionální variabilitu v druhových spektrech. Shromážděné anamnestické údaj k případům budou použity pro zlepšení diagnostiky a prevence dermatofytóz. Anamnestická a epidemiologická data, a údaje o úspěchu léčby shromážděné v rámci tohoto projektu budou využity pro zlepšení empirické terapie.
Další část práce se bude věnovat monitoringu epidemiologie mykotických infekcí působených některými druhy dermatofytů molekulárně genetickými metodami. Zvláštní pozornost bude věnována infekcím způsobeným druhem Arthroderma benhamiae, který byl ještě před několika lety naprosto nevýznamný, ale v současnosti působí epidemii infekcí ve střední Evropě. Tato epidemie je díky probíhající studii nejlépe zdokumentována právě v ČR (stovky případů s detailními údaji o klinickém obrazu a léčbě) a schéma založené na molekulárně genetických metodách (mikrosatelity, typizace sekvenováním několika genetických lokusů) pro účely monitoringu šíření infekce bylo předmětem diplomové práce studentky. Přínosem tohoto schématu bylo i zjištění, že většinu infekcí působí jediný genetický klon, který se odštěpil od běžné populace této zoofilní houby, která jinak napadá především hlodavce (morčata, činčily, apod.), a na člověka se v minulosti téměř nepřenášela. Další výzkum by měl specifikovat faktory virulence tohoto výjimečného klonu, což by významně přispělo k poznání o patogenezi povrchových mykóz (viz níže). Díky zahraniční spolupráci se pro typizaci podařilo získat izoláty z mnoha dalších evropských zemí (Německo, Belgie, Švýcarsko, Itálie, aj.), ale také z Japonska a USA. Zařazení těchto izolátů by mělo ozřejmit, jestli existuje vztah mezi zastoupením genotypů v závislosti na geografickém původu izolátů. Typizace se bude týkat i dalších druhů dermatofytů, např. T. verrucosum, který je původcem profesionálních nákaz u pracovníků se skotem.

2. Taxonomická část
Cílem je vytvoření popisu nových druhů zachycených v epidemiologické studii. Druhy budou popsány pomocí polyfázického přístupu zahrnujícího sekvence DNA z několika lokusů (ITS a LSU rDNA, gen pro β-tubulin, aktin a RNA polymerázu II), mikro- a makromorfologii a fyziologii.
Vytvořit novou příručka pro identifikaci klinicky významných dermatofytů vyskytujících se v Evropě (cca 20-25 druhů). Jednotlivé druhy budou reprezentovány izoláty identifikovanými molekulárními metodami (získané během tohoto projektu i ze zahraničních sbírek kultur hub) a charakterizovány pomocí makromorfologie (růst na standardních médiích), mikromorfologie, růstu v teplotním gradientu (obr. 3 a 4), standardními fyziologickými a biochemickými testy (T1-T7 média, ureázový test, test perforace vlasu, apod.).
Pohlavní stádium dermatofyt - navození tvorby pohlavního stádia za různých podmínek (přístup vzduchu, světelné podmínky, kultivační media, přítomnost jiného mikroorganismu, vysychání, zavodnění, přítomnost keratinu získaného z různých zdrojů).

3. Faktory virulence
Sekundární metabolity
Sekundární metabolity jsou spolu s proteolytickými enzymy považovány za hlavní faktory virulence u dermatofytů. Problematika sekundárních metabolitů u této skupiny dosud nebyla intenzivně studována, přestože se ukazuje, že dermatofyty produkují široké spektrum metabolitů zatím neznámé povahy (Achterman & White 2013,Burmester et al 2011,Gupta et al 2000,Tainwala & Sharma 2011,Weitzman & Summerbell 1995). U jednoho z doposud nalezených metabolitů byly prokázány silně toxické účinky (Gupta et al 2000) a u dalších látek zatím neznámé struktury byly pozorovány antibiotické schopnosti (Hammadi et al 2007). Otázkou tedy zůstává jaký je vliv těchto metabolitů na tkáně hostitele.
Analýza sekundárních metabolitů u vybraných kmenů bude provedena pomocí rozpouštědlové extrakce a extrakce na pevné fázi metodou vysoko účinné kapalinové chromatografie (HPLC) případně metodou extrémně účinné kapalinové chromatografie (UPLC) s následnou detekcí na UV detektoru. Vlastní struktura látek bude zjišťována metodou hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením (HRMS) a spektroskopie nukleární magnetické resonance (NMR). U některých z takto nalezených metabolitů proběhne vyšetření na možnou biologickou aktivitu. Zjišťována bude také produkce těchto látek v tkáni hostitele.
Výzkum bude realizován v mikrobiologickém ústavu AVČR.

Časový harmonogram projektu:
1. rok: sběr dat
2. rok: sběr a analýza dat
3. rok: sběr a analýza dat, příprava rukopisů
4. rok: závěrečné analýzy dat, příprava rukopisů, odevzdaní doktorského projektu
PODPORA:GAUK 8615 (od r. 2015)

Achterman RR, White TC. 2013. Dermatophytes. Current Biology 23: 551-2
Burmester A, Shelest E, Glockner G, Heddergott C, Schindler S, et al. 2011. Comparative and functional genomics provide insights into the pathogenicity of dermatophytic fungi. Genome Biol 12: R7
Gupta AK, Ahmad I, Borst I, Summerbell RC. 2000. Detection of xanthomegnin in epidermal materials infected with Trichophyton rubrum. Journal of investigative dermatology 115: 901-5
Hammadi D, Selselet G, Bensoultane S. 2007. Antibiotic like-substances produced by some trichophytic dermatophytes. African Journal of Biotechnology 6: 1788-90
Tainwala R, Sharma Y. 2011. Pathogenesis of dermatophytoses. Indian journal of dermatology 56: 259-61
Weitzman I, Summerbell RC. 1995. The dermatophytes. Clinical microbiology reviews 8: 240-59