Cytochrome P-450: Study of structure and interactions using chemical modification, photo-initiated cross-linking and mass spectrometry

• Thesis title in Czech: Cytochrom P-450: studium struktury a interakcí metodami chemické modifikace, foto-iniciovaného síťování a hmotnostní spektrometrie
• Thesis title in English: Cytochrome P-450: Study of structure and interactions using chemical modification, photo-initiated cross-linking and mass spectrometry
• Key words: cytochrom P-450, foto-iniciované síťování, modifikace proteinů, hmotnostní spektrometrie
• English key words: cytochrome P-450, photo-initiated cross-linking, protein modification, mass spectrometry
• Academic year of topic announcement: 2010/2011
• Thesis type: dissertation
• Thesis language: angličtina
• Department: Department of Biochemistry (31-250)
• Supervisor: doc. RNDr. Miroslav Šulc, Ph.D.
• Author: hidden - assigned and confirmed by the Study Dept.
• Date of registration: 01.10.2010
• Date of assignment: 01.10.2010
• Date and time of defence: 29.06.2015 13:00
• Date of electronic submission: 11.05.2015
• Date of proceeded defence: 29.06.2015
• Opponents: doc. RNDr. Jiří Petrák, Ph.D.
• Advisors: prof. doc. Ing. Vladimír Havlíček, Dr.

Preliminary scope of work

Náplní práce je mapování interakcí proteinů systému oxygenas se smíšenou funkcí s jejich vazebnými partnery a substráty. Studována bude především struktura aktivního centra, vstupního kanálu a membránové domény cytochromu P-450 (P-450) a interakce P?450 s?vazebnými partnery (cytochrom b5, cytochrom P-450 reduktasa). K tomuto účelu budou použity dvě metody, fotoafinitní značení a chemická modifikační činidla, ve spojení s lokalizací kovalentních aduktů vzniklých fotoafinitním značením či chemickou modifikací proteinů hmotnostní spektrometrií (MS).
Fotoaktivní analogy sloučenin, které se váží jako ligandy či substráty P-450, jsou při interakci se studovaným proteinem aktivovány UV světlem ve fotolyzéru. Vzniklé reaktivní intermediáty s proteinem v místě přiblížení tvoří kovalentní vazbu, která může být následně identifikována (MS). Podobně do sekvence rekombinantního proteinu inkorporované fotoaktivní analogy aminokyselin mohou vytvářet kovalentní vazbou mezi interagujícími proteiny. Ke studiu interakce P-­­450 s vazebnými partnery budou také použita chemická modifikační činidla obsahující reaktivní koncové skupiny, které umožňují spojení specifických aminokyselinových zbytků dvou interagujících proteinů. Všechny použité metody po lokalizaci cílových aminokyselin pomocí MS poskytují informace o prostorovém uspořádání proteinů, a vazbě substrátu, ligandu či redoxního partnera.
Vzhledem k dispozici in silico homologního modelu P-450 2B4 v naší laboratoři budou experimentální postupy testovány a optimalizovány na této izoformě a povedou k objasnění vztahu mezi strukturou a funkcí tohoto P-450.

Preliminary scope of work in English

The aim of this project is primarily structural study of the active site, the access channel and the membrane domain of cytochrome P-450 (P-450). Secondly, the interactions of P-450 with its redox partners (cytochrome b5, cytochrome P450 reductase) in mixed function oxygenases system will be explored. For this purpose two methods of covalent adducts formation will be employed, photoaffinity labelling and chemical modification, followed with covalent adduct analysis by mass spectrometry (MS).
Photoactive group of ligand and substrate analogues will be activated by UV light during interaction with P-450 to form covalent bond with vicinal protein residues. Similarly P-450 will be covalently linked with recombinant redox partners containing incorporated photoactive aminoacid analogues. Further, batery of modification agents reacting with specific amino acid side chains will be used to cross-link P-450 with its redox partners. After MS identification of target aminoacid residues all used methods provide information about protein spatial arrangement and its interaction domain for substrate, ligand or redox partner.
Research results will contribute to in silico improving of cytochrome P450 2B4 homology model, previously prepared in our laboratory, and enlightening the structure?function relationship of this P-450.