Regulační T buňky (Treg) jsou jedním z nejdůležitějších regulačních mechanismů imunitního sytému. Treg tlumí imunitní reakce a brání nadměrné aktivaci imunitního sytému. Je popsáno mnoho mechanismů jejich působení. V naší práci jsme se zaměřili na studium role makrofágů v imunosupresi zprostředkované Treg.Supresorové vlastnosti purifikované populace Treg získané magnetickou separací byly prokázány v proliferačních testech. V závislosti na přítomnosti makrofágů byla pozorována rozdílná suprese proliferace při různých způsobech aktivace efektorových lymfocytů. Treg tlumily v přítomnosti makrofágů proliferaci efektorových lymfocytů více. Toto pozorování vedlo k hypotéze o působení Treg na makrofágy. Metodou průtokové cytometrie však nebylo zjištěno snížení exprese kostimulačních molekul CD80, CD86 nebo CD40 a MHCII molekul na makrofázích kultivovaných v přítomnosti Treg. Ve funkčních testech makrofágy prekultivované s Treg vykazovaly stejnou kostimulační schopnost jako makrofágy prekultivované samotné. Nebylo prokázáno ani cytotoxické působení Treg na makrofágy a to jak metodou průtokové cytometrie, tak metodou live cell imaging.V jiných modelech, kde docházelo k silnější aktivaci efektorových buněk, Treg proliferaci neinhibovaly i přes přítomnost makrofágů. To vedlo k hypotéze, že by rozdíly v supresi v přítomnosti makrofágů mohly být způsobeny kvantitativně nebo kvalitativně odlišnou aktivací efektorových buněk. Pomocí metod ELISA a q-PCR bylo testováno množství IL-2 v kultuře a jeho produkce efektorovými lymfocyty. Ukázalo se, že produkce IL-2 negativně korelovala s mírou suprese. Navíc přidání exogenního IL-2 supresi eliminovalo. Treg tlumily produkci IL-2 na genové úrovni a relativní exprese genu pro IL-2 korelovala s mírou suprese v původních proliferačních testech. Dříve pozorované rozdíly v supresi jsou tedy pravděpodobně způsobeny rozdílnou kvantitou nebo kvalitou aktivace efektorových lymfocytů a Treg v našich modelech působí tlumením produkce IL-2.
Preliminary scope of work in English
Regulatory T cells (Treg) represent one of the most important mechanisms of immunoregulation. Treg suppress immune reactions and prevent overactivation of the immune system. There are a lot of ways of Treg action described, here we have focused on Treg interference with macrophages.The suppressor capacity of a highly purified Treg population was demonstrated in proliferation assays. The level of suppression of effector T cell proliferation differs depending on the presence of macrophages in the culture. Treg-mediated suppression was significantly higher in the presence of macrophages. These observations led to hypothesis that Treg affect directly macrophages. However, using flow cytometry, reduction of expression of costimulatory molecules on macrophages after culture with Treg was not observed. Macrophages precultured with Treg showed a comparable functionality as macrophages cultured alone. Neither flow cytometry nor live cell imaging revealed any cytotoxic activity of Treg towards macrophages.Despite the presence of macrophages, Treg did not suppress effector cell proliferation in a model where stronger activation of effector cells was induced. Therefore, a new hypothesis was proposed – initially observed higher suppression in the presence of macrophages was probably caused by a qualitatively or quantitatively different activation of effector lymphocytes. The amount of activation cytokine IL-2 in the cultures and its production by effector T cells was tested using ELISA and q-PCR. Negative correlation between the amount of IL-2 and the level of Treg suppression was observed. The level of IL-2 in the culture and of IL-2 mRNA were higher in the cultures where Treg did not suppress proliferation. Moreover, the addition of exogenic IL-2 abrogated the suppression. Treg suppressed production of IL-2 on the level of the gene expression and relative gene expression of IL-2 correlated with the level of Treg suppression in original proliferation assays. The differences in the suppression of cell proliferation were probably caused by qualitatively or quantitatively different activation of effector lymphocytes and Treg suppressed production of IL-2 by effector cells.Keywords: regulatory T cells, immunosuppression, macrophages, IL-2 production.
- assigned by the advisor