Úloha de novo DNA metyltransferáz v transkripčnom umlčovaní retrovírusov a retrovírusových vektorov odvodených od vtáčieho sarkómového a leukózového vírusu
Thesis title in thesis language (Slovak):
Úloha de novo DNA metyltransferáz v transkripčnom umlčovaní retrovírusov a retrovírusových vektorov odvodených od vtáčieho sarkómového a leukózového vírusu
Thesis title in Czech:
Úloha de novo DNA methyltransferáz v transkripčním umlčování retrovirů a retrovirových vektorů odvozených od ptačího sarkomového a leukozového viru
Thesis title in English:
The role of de novo DNA methyltransferases in transcriptional silencing of retroviruses and retroviral vectors derived from avian sarcoma and leukosis virus
Key words:
Metylácia DNA, de novo DNA metyltransferázy, retrovírusové vektory odvodené od ASLV, transkripčné umlčovanie, epigenetické modifikácie.
English key words:
DNA methylation, de novo DNA methyltransferases, ASLV derived vectors, transcriptional silencing, epigenetic modification.
Retrovírusové vektory odvodené od vtáčieho sarkómového a leukózového vírusu (ASLV) sa účinne replikujú vo vtáčích bunkách, ale k ich replikácii v cicavčích bunkách nedochádza. Integrácia vektorov odvodených od ASLV je nenáhodná, s nízkou preferenciou integrácie do oblastí bohatých na gény, transkripčných štartov, či CpG ostrovov. Okrem toho majú slabú preferenciu integrácie do blízkosti génov podporujúcich vznik tumorov. Preto vektory odvodené od ASLV sú pomerne bezpečné a výhodné pre použitie v génovej terapii a vakcinácii. Jednou z prekážok použitia vektorov odvodených od ASLV v génovej terapii je transkripčné umlčanie integrovaných provírusov. Postupné umlčanie vektoru veľmi úzko súvisí s epigenetickými zmenami vrámci dlhých repetitívnych sekvencií (LTR). V oblasti promotorov integrovaných provírusov bola detekovaná bohatá metylácia CpG dinukleotidov a histónové modifikácie, ktoré vedú k umlčaniu vektoru. Cieľom tejto diplomovej práce bolo zistiť vplyv de novo DNA metyltransferáz v transkripčnom umlčaní ASLV provírusov v kuracích a ľudských bunkách. V prvom rade sme chceli zistiť, či cicavčia DNMT3a ako holoenzým je schopná rozpoznať integrovaný vtáčí provírus a umlčať ho. Pre tento cieľ sme využili bunkovú líniu DF-1, v ktorej prostredníctvom zavedeného cicavčieho inducibilného systému dochádzalo k zvýšenej expresii cicavčej DNMT3a. Okrem metyltransferázy DNMT3a sme sa zaoberali vplyvom de novo DNMT3b na umlčovanie vektorov odvodených od ASLV. K tomu sme využili HCT116 bunkovú líniu divokého kmeňa a líniu deficientnú na DNMT3b, ktoré sú odvodené od ľudského kolorektálneho karcinómu. Pre zistenie stability a mechanizmu umlčania boli klony s umlčanými provírusmi reaktivované 5-aza-cytidínom (5-azaC)a trichostatinom A (TSA). Metylačný stav LTR sekvencií umlčaných provírusov bol analyzovaný bisulfitovou konverziou a sekvenáciou. Naše výsledky naznačujú že myšacia DNMT3a exprimovaná v kuracích bunkách línie DF-1 nie je schopná rozpoznať integrované provírusy a umlčať ich metyláciou DNA. Naše výsledky taktiež poukazujú na to, že DNMT3b hrá veľmi podstatnú úlohu v transkripčnom umlčaní provírusov a je esenciálnou komponentou umlčovacieho mechanizmu, ktorý je závislý na de novo metylácii. Provírusy klonov divokého kmeňa boli účinne reaktivované 5-azaC, pričom provírusy klonov DNMT3b deficientnej línie boli oveľa viac reaktivované TSA.
Preliminary scope of work in English
Avian sarcoma and leukosis virus-based (ASLV) vectors are retrovirus-derived vectors that can replicate efficiently in avian cells, but are replication-defective in mammalian cells. ASLV genome integration is nonclustered, does not favor gene-rich regions, transcription start sites, or CpG islands. There was no propensity for ASLV insertions within or near proto-oncogenes. Thus, they are quite safe and advantageous for use in gene therapy and vaccines. One of the obstacles to the use of ASLV-derived vectors in mammalian cells is the transcriptional silencing of integrated proviruses. In general, gradual silencing of transduced vectors correlates with epigenetic changes of retroviral long terminal repeats (LTRs). CpG methylation of DNA and/or modifications of histones in nucleosomes linked to the promoter region were found in silenced proviruses in vitro. The aim of this diploma thesis was to reveal the influence of the de novo DNA methyltransferases (DNMT) on transcriptional silencing of integrated ASLV proviruses in chicken and human cells. We wanted to find out, if mammalian DNMT3a as holoenzyme is able to recognize integrated avian provirus and silence it. For this purpose we used chicken cell line DF-1, where high level of expression of mammalian DNMT3a induced by mammalian inducible system is present. We also wanted to discover whether human de novo DNMT3b has an influence on silencing of ASLV retroviral vector. Therefore we used wild type (WT) and DNMT3b deficient cell lines HCT116 derived from colorectal carcinoma. Clones with silent proviruses were chosen for reactivation by 5-aza-cytidine (5-azaC) and trichostatin A (TSA) to recover the stability and way of proviral silencing. Proviral methylation statuses of these proviruses were disclosed by bisulfide conversion and sequencing. Our results proved that mouse DNMT3a is not able to silence integrated provirus by methylation in chicken cell line DF-1. Our data also reveal that DNMT3b plays very important role in proviral silencing and is essential component of de novo methylation dependent proviral mechanism of silencing. Proviruses in WT clones were efficiently reactivated by 5-azaC and proviruses in clones of DNMT3b deficient cell line were much more efficiently reactivated by TSA.
- assigned by the advisor