Application of novel photo-induced techniques for structural and functional proteomics

• Thesis title in Czech: Strukturně-funkční proteomika s využitím nových světlem indukovaných technik
• Thesis title in English: Application of novel photo-induced techniques for structural and functional proteomics
• Key words: světlem-iniciované síťování/modifikace proteinů/přenos elektronu, proteomika, hmotnostní spektrometrie
• English key words: photo-induced cross-linking/protein modification/electron transfer, proteomics, mass spectrometry
• Academic year of topic announcement: 2020/2021
• Thesis type: dissertation
• Thesis language: angličtina
• Department: Department of Biochemistry (31-250)
• Supervisor: doc. RNDr. Miroslav Šulc, Ph.D.
• Author: hidden - assigned by the advisor
• Date of registration: 02.10.2020
• Date of assignment: 08.10.2020

Preliminary scope of work

Předkládaný projekt disertační práce bude zaměřen na strukturně-funkční studium azurinu (elektrotransportního „cupredoxinu“) pomocí technik světlem iniciovaného uvolnění elektronu (PIER) a chemického síťování (PIXL)
Předkládaný projekt disertační práce bude studovat azurin - modrý protein, který obsahuje v aktivním centru měď a patří do skupiny „cupredoxinů“ běžně používaných jako model pro studium elektro-transportních jevů (ET). V práci budou řešeny tři základní cíle: (i) rozvoj a evaluace nové techniky světlem indukovaného uvolnění elektronu (z angl. PIER) jako alternativní techniky pro iniciaci ET reakcí v proteinech, (ii) studium a popis oligomerizace azurinu v roztoku a mapování protein-proteinových kontaktů pomocí techniky světlem indukuvaného síťování (z angl. PIXL), a (iii) určení role klíčových aminokyselinových zbytků pro ET procesy v azurinu.
Pro nalezení odpovědí na vytyčené cíle budou použity následující metodické postupy:
a. Rekombinantní exprese a purifikace přirozeného a mutantních forem azurinu s inkorporovanými fotoreaktivními strukturními analogy methioninu (foto-Met) do proteinové sekvence.
b. PIXL a PIER: ze začleněných foto-Met do sekvence proteinu po ozáření UV-světlem vznikají reaktivní částice s krátkou dobou života, které mohou vytvářet nové kovalentní vazby/zesítění (PIXL) nebo iniciovat ET proces (PIER) v závislosti na pozici a funkci v sekvenci azurinu. Získané výsledky PIER budou srovnávány s referenční metodikou běžně používanou pro studium ET - značení azurinu Re-komplexy. Výsledky PIXL experimentů budou porovnány s výsledky analytické ultracentrifugace, známými strukturami pdb či informacemi v literatuře.
c. Hmotnostní spektrometrie (MS) a molekulární dynamika/modelování: kovalentní zesítění identifikovaná pomocí MS „top-down“ přístupu budou použita pro simulaci 3D struktur azurinu (intramolekulární zesítění) a protein-proteinových interakcí (intermolekulární zesítění) s následnou ilustrací získaných strukturních dat pomocí in-silico modelování.
d. Na základě výsledků PIXL a PIER experimentů budou navrženy a pomocí místně cílené mutagenese zkonstruovány nové mutantní formy azurinu a jejich purifikované rekombinantní proteiny s vloženými foto-Met budou použity pro potvrzení a rozšíření získaných strukturně funkčních informací.
Předpokládáme, že (i) technika PIER přispěje k lepšímu pochopení ET procesů s vyloučením nevýhod klasické techniky využívající značení proteinů Re-komplexy, (ii) technika PIXL by měla rozšířit znalosti o strukturně-funkčním chování azurinu s eliminací nevýhod klasické techniky chemického síťování.

Preliminary scope of work in English

This project deals mainly with structural-functional study of azurin (blue copper protein) employing techniques of photo induced electron release (PIER) and cross-linking (PIXL)
Proposed dissertation project deals with P. aeruginosa azurin, a member of blue copper proteins also known as cupredoxins, which is commonly used as a model protein for electron transfer/transport (ET) studies. Three major goals are defined: (i) to explore and evaluate photo-induced electron release (PIER) as an alternative technique for initiation of ET reactions in proteins, (ii) to describe oligomerization of azurin in solution and to map contacts in protein-protein interaction via photo-induced cross-linking (PIXL), and (iii) to investigate the role of key amino-acids in ET occurring in azurin.
For these purposes the following techniques will be employed:
a. Recombinant expression and purification of wild type azurin and its mutants to introduce photo reactive structural analogues of methionine (photo-Mets) into the protein sequence.
b. PIXL & PIER: incorporated photo-Mets yield highly reactive short life-time species after UV light activation and are able to form a new covalent bond/cross-link (PIXL) or initiate an ET process (PIER) depending on its position or function in azurin sequence. PIER results will be compared to a reference method commonly used for ET research (azurin Re-complex labelling). PIXL results will be referenced to our data from analytical ultracentrifugation and previously published pdb structures or other structural information.
c. Mass spectrometry & molecular dynamics modelling: new covalent cross-links formed during PIXL experiments will be analysed via top-down mass spectrometry and determined constraint distances will be used for in-silico modelling to illustrate structural data by simulation of azurin 3D structure (intramolecular XL) or protein-protein interactions (intermolecular XL).
d. Design and construction of new mutants of azurin based on PIXL & PIER results applying site directed mutagenesis and their recombinant expression with photo-Mets (confirmation and extension of acquired structure-functional data).
We hope that: (i) PIER will allow us to achieve better understanding of ET processes, while excluding disadvantages of classical methodological approach using Re-complex labelling technique, (ii) PIXL will extend our knowledge on structure-functional behaviour of azurin.