Stanovení mutačního spektra a frekvenčního zastoupení variant u genů zapojených v signalizační kaskádě melanokortinového receptoru 4. typu (MC4R)

• Thesis title in Czech: Stanovení mutačního spektra a frekvenčního zastoupení variant u genů zapojených v signalizační kaskádě melanokortinového receptoru 4. typu (MC4R)
• Thesis title in English: Determination of mutation spectrum and frequency representation of variants in genes involved in Melanocortin Receptor Type 4 Signaling Cascade (MC4R)
• Key words: Obezita, Monogenní obezita, MC4R, POMC,SIM1, BDNF
• English key words: Obesity, Monogenic obesity, MC4R, POMC, SIM1, BDNF
• Academic year of topic announcement: 2019/2020
• Thesis type: diploma thesis
• Thesis language: čeština
• Department: Department of Anthropology and Human Genetics (31-110)
• Supervisor: Mgr. Josef Včelák
• Author: hidden - assigned by the advisor, waiting for guarantor's approval
• Date of registration: 19.11.2019
• Date of assignment: 19.11.2019
• Date of electronic submission: 25.04.2022
• Date of proceeded defence: 01.06.2022
• Opponents: doc. MUDr. Irena Aldhoon Hainerová, Ph.D.

Preliminary scope of work

Anotace:
V roce 2018 schválila Evropská komise pod názvem “Setmelanotide” první lék z řady uměle připravených agonistů melanokortinového receptoru 4. typu (MC4R) pro léčbu vybraných vzácných onemocnění - specifického typu monogenní obezity způsobené špatnou funkcí leptinového receptoru (LEPR). Tito agonisté napodobují účinek melanocyty stimulujícího hormonu (α-MSH), čímž ovlivňují celou signalizační kaskádu MC4R a ve svém důsledku hypothalamická centra řídící příjem potravy.
Aktuálně probíhá řada klinických studií s agonisty MC4R i u jiných vzácných typů monogenní obezity, např. u pacientů s deficitem proopiomelanokortinu (POMC) a dále u vybraných syndromů taktéž spojených s extrémní obezitou, např. u Prader-Willi syndromu, Bardet-Biedl syndromu a Alströmova syndromu.
Pokud se u těchto léčiv neprokážou nežádoucí vedlejší účinky, mohly by agonisté MC4R hrát důležitou roli i při léčbě širšího spektra příčin obezity.
V současnosti nejsou dostupné údaje o zastoupení mutací v signalizační kaskádě MC4R ve větším souboru české populace a není proto známa velikost cílové skupiny pacientů, kterým by tato léčba mohla pomoci.
Při molekulárně-genetickém vyšetření těchto genů se často nachází dosud nepopsané varianty. Pro interpretaci významu těchto variant v rozvoji obezity je nutné znát zastoupení jednotlivých variant jak u obézních jedinců, tak u běžné populace.

Cíl
Cílem diplomové práce bude stanovit mutační spektrum a frekvenční zastoupení jednotlivých variant ve vybraných genech spojených s monogenní obezitou kódujících signalizační kaskádu MC4R (geny MC4R, POMC, SIM, BDNF) u české obézní populace.

Rozsah diplomové práce studenta:
Soubor
Soubory DNA, které budou využity pro sekvenační analýzu vybraných genů, pocházejí z projektu COPAT (Childhood Obesity Prevalence And Treatment). První je soubor adolescentů s nadváhou nebo obezitou (BMI z-skóre nad 90. percentilem) a zahrnuje 700 jedinců ve věku 13-18 let. Druhý představuje běžnou populaci 700 stejně starých adolescentů, kteří byli náhodně vybráni a vyšetřeni v pediatrických ordinacích napříč celou ČR.
Sekvenační analýza
Školitel zvolí a zajistí vhodnou technologii přípravy DNA knihoven pro sekvenování nové generace (NGS) pro velký počet vzorků a relativně malý počet genů. Z důvodu vysoké finanční náročnosti bude DNA knihovny studentka připravovat pod vedením školitele. Samostatně bude provádět kontrolu připravených knihoven na Bioanalyzéru a jejich kvantifikaci. Nasazení knihoven do sekvenátoru (vlastní sekvenaci na sekvenátoru MiSeq Illumina) bude opět provádět pod přímým vedením školitele.
Bioinformatika
Studentka po zaučení školitelem provede sama vyhodnocení sekvenačních dat na Linuxovém serveru FinalistDX s následným tříděním a filtrováním získaných variant (.vcf soubory) v Excelu.
Tato data srovná s výsledky poskytnutými softwarem sekvenátoru (MiSeq Reporter).
Anotace z kauzality podezřelých variant (nalezené vzácné varianty u obézních jedinců) včetně jejich interpretace bude po zaškolení samostatně provádět přes veřejně dostupné databáze a anotační nástroje (např. VarSome, dbSNP, ClinVar atd.).
Výsledky budou srovnány s výsledky obdrženými nezávisle školitelem (systém čtyř očí) a sporné nálezy a interpretace budou se studentkou diskutovány.

Populačně genetická/statistická analýza výsledků
Studentka bude proškolena v základech statistiky (Chi2-test, ANOVA, logistická regrese) pro populačně genetickou analýzu dat ve stanovených polymorfismech těchto genů.
Primárně porovná frekvenční zastoupení variant polymorfismů u obou kohort českých adolescentů a srovná je s veřejně dostupnými daty z jiných populací.
Školitel studentce pro základní asociační studii připraví vhodně transformovaná data vybraných biochemických a antropometrických parametrů od obou kohort. Studentka bude pod vedením školitele provádět vyhodnocení programy NCSS a Statgraphics.

Diplomová práce bude podporována z Institucionální podpory Endokrinologického ústavu MZ ČR RVO 00023761.