Projekt je zaměřen na využití hmotnostní spektrometrie jako detekčního nástroje pro nové techniky v oblasti strukturní a funkční proteomiky, známé jako světlem iniciované síťování (PIXL) a světlem iniciované uvolňování elektronů (PIER), které slouží jako alternativní techniky pro mapování proteinových interakcí či studium reakcí přenosu elektronů v proteinech. Za tímto účelem budou do proteinové sekvence za pomoci rekombinantní exprese inkorporovány různé foto-reaktivní strukturní analogy aminokyseliny methioninu. Tyto tzv. foto-methioniny po inkorporaci do sekvence proteinu, jsou schopné tvořit po aktivaci UV světlem vysoce reaktivní intermediáty (karbény nebo radikály)a následně iniciovat buď tvorbu nové kovalentní vazby/síťovat se (PIXL) či proces přenosu elektronů (PIER) v závislosti na své pozici nebo funkci ve struktuře proteinu. Výsledná proteinová směs po PIXL nebo PIER experimentu bude analyzována pomocí různých přístupů metodou hmotnostní spektrometrie. Pro potvrzení nebo vyloučení získaných MS dat budou konstruovány nové mutanty místně specifickou mutagenezí a experimenty PIXL a PIER budou zopakovány s připravenými proteiny s obsahem foto-methioninů. Současně budou paralelně prováděny paralelní experimenty s aplikací dalších komplementárních technik, jako je analytická centrifugace, nativní elektroforéza nebo stanovení přenosu elektronu v proteinech po světlem indukovaném přenosu z Re-komplexu.
Preliminary scope of work in English
This project deals with application of mass spectrometry as detection tool for two novel techniques of structural and functional proteomics, photo-induced cross-linking (PIXL) and photo-induced electron release (PIER), as an alternative technique for mapping contacts in protein-protein interactions or studying of electron transfer reactions in protein. For these purposes different photo reactive structural analogues of Met (photo-Mets), will be introduced into the protein sequence via recombinant expression. The incorporated photo-Mets yield highly reactive species (carben or radicals) after UV light activation and are able to form new covalent bond/cross-link (PIXL) or initiate electron transfer process (PIER) depending on its position or function in protein’s sequences. The resulted mixture of protein species will be analyzed by different approaches utilizing mass spectrometry. To confirm or exclude the obtained data, new mutants will be constructed by site directed mutagenesis and proteins with photo-Mets will be produced together with parallel application of another complementary techniques such as analytical ultracentrifugation, native electrophoresis or electron induced Re complex protein labelling.
- assigned by the advisor