Transkripční faktory rodiny Pax6 jsou významnými regulátory embryonálního vývoje. Obsahují dvě nezávislé vazebné domény, homeodoménu a paired doménu, pomocí nichž se váží na regulační oblasti cílových genů a určují jejich expresní stav. Naším cílem bude přispět k objasnění role transkripčního faktoru Pax6, který je považovaný za klíčový regulátor vývoje oka. V projektu bude využito embryí myších kmenů divokého typu, kondicionálních knockoutů v genu Pax6 a transgenního kmene produkujícího epitopově značený protein Pax6 (viz dílčí cíl 1). S využitím kombinace metod chromatinové imunoprecipitace (ChIP-seq) a diferenciální expresní analýzy mRNA (microarray, RNA-seq) se zaměříme na hledání genů regulovaných proteinem Pax6 ve vyvíjejícím se myším embryu. Expresní profilování bude provedeno porovnáním buněk embryí divokého typu a buněk mutantních pro gen Pax6. Pro biochemické účely bude využito i metody diferenciace myších embryonálních kmenových buněk in vitro na neuronální progenitorové buňky sítnice (Eiraku et al., 2011). Metoda in vitro diferenciace sítnicových buněk z embryonálních kmenových buněk umožní identifikaci genů regulovaných proteinem Pax6 během vývoje individuální tkáně, odděleně od tkání ostatních, a také umožní připravit dostatečné množství biologického materiálu na ChIP-seq. Výsledkem těchto studií bude určení genů, které jsou přímo nebo nepřímo regulované transkripčním faktorem Pax6 a jsou tedy součástí jeho genové regulační sítě. Následně bude u vybraného genu geneticky charakterizován jeho význam pro embryonální vývoj metodou kondicionálního knockoutu.
- assigned by the advisor