Analýza vlivu mutací v C-terminální doméně na vnitrobuněčnou lokalizaci nukleofosminu

• Thesis title in Czech: Analýza vlivu mutací v C-terminální doméně na vnitrobuněčnou lokalizaci nukleofosminu
• Thesis title in English: Analysis of the intracellular localization of nucleophosmin: effect of C-terminal mutations
• Key words: mutovaný nukleofosmin, leukémie, vnitrobuněčná lokalizace, oligomerizace, jadérko, exprese nukleofosminu
• English key words: mutated nucleophosmin, leukemia, intracellular localization, oligomerization, nucleolus, nucleophosmin expression
• Academic year of topic announcement: 2014/2015
• Thesis type: diploma thesis
• Thesis language: čeština
• Department: Department of Genetics and Microbiology (31-140)
• Supervisor: Mgr. Barbora Brodská, Ph.D.
• Author: hidden - assigned by the advisor, waiting for guarantor's approval
• Date of registration: 16.10.2014
• Date of assignment: 22.10.2014
• Date of electronic submission: 15.08.2016
• Date of proceeded defence: 14.09.2016
• Opponents: RNDr. Michal Čáp, Ph.D.

Preliminary scope of work

Cílem práce je pomocí fluorescenční mikroskopie popsat vnitrobuněčnou lokalizaci nukleofosminu v závislosti na mutacích charakteristických pro akutní myeloidní leukémii.
Metody
Western blotting: hladina exprese NPM v buněčném lyzátu
Imunofluorescence: lokalizace proteinu na fixovaných buňkách leukemických linií (konfokální mikroskop)
Molekulární klonování a live-cell imaging: konstrukce plazmidů nesoucích gen pro nukleofosmin, cílená tvorba specifických mutací (site-directed mutagenesis); transfekce buněk chemickou cestou (adherentní buněčné linie) nebo nukleofekcí (suspenzní linie); lokalizace v buňkách nádorových linií transfekovaných plazmidem nesoucím intaktní nebo mutovaný gen pro NPM fúzovaný s genem pro fluorescenční protein (eGFP, mRFP)
Metody jsou na pracovišti školitele zavedeny a veškerá potřebná přístrojová technika je k dispozici.
Teze
Přibližně třetina pacientů s akutní myeloidní leukémií má mutaci v C-koncové části genu pro nukleofosmin (NPM), fosfoprotein účastnící se v buňkách řady procesů včetně tvorby ribosomálních podjednotek, kontroly dělení jádra nebo procesu apoptózy. V interfázních buňkách se NPM nachází převážně v jadérku a za tuto lokalizaci jsou zodpovědné nucleolar localization signal (NLS) sekvence nacházející se v exonu 12 genu NPM1. Mutace v této oblasti jsou charakterizovány ztrátou NLS a v případě nejčastější mutace typu A také vytvořením nuclear export signal (NES). Produkt takto mutovaného genu je pak lokalizován v cytoplazmě. Přítomnost mutace NPM je obecně pozitivním prognostickým faktorem pro léčbu AML a předpokládá se, že příznivá odpověď na léčbu souvisí s aberantní lokalizací nukleofosminu. U některých minoritních mutací (typ B, J, Gm) však aditivní NES nevzniká a lokalizace produktu takto změněného genu nebyla s jistotou určena. Z našich nedávných zjištění vyplývá, že mutovaný nukleofosmin indukuje imunitní odpověď in vivo a že také tato imunogenicita je spíše důsledkem odlišné lokalizace než změny v kódující sekvencí (ref.). Analýza vztahu mezi typem mutace a lokalizací mutovaného proteinu přispěje k pochopení vlivu mutace NPM1 na vývoj AML a ke zpřesnění prognostického významu podle typu mutace. Téma je rovněž součástí letošní grantové aplikace pro AZV MZ ČR.