Optimalizace postupů pro kvantifikaci miRNA z tenkojehlových bioptických vzorků karcinomu pankreatu.

• Thesis title in Czech: Optimalizace postupů pro kvantifikaci miRNA z tenkojehlových bioptických vzorků karcinomu pankreatu.
• Thesis title in English: Optimization of miRNA analysis in fine-needle biopsy samples of pancreatic cancer tissue.
• Key words: Karcinom pankreatu, EUS-FNB, biopsie tenkou jehlou, miRNA, optimalizace, chronická pankreatitida, izolace RNA, izolace DNA, qRT-PCR, heteroduplexní analýza, KRAS, diagnostika, prognóza.
• English key words: Pancreatic cancer, EUS-FNB, fine needle biopsy, miRNA, optimization, chronic pancreatitis, RNA isolation, DNA isolation, qRT-PCR, heteroduplex analysis, KRAS, diagnostics, prognosis.
• Academic year of topic announcement: 2012/2013
• Thesis type: diploma thesis
• Thesis language: čeština
• Department: Department of Genetics and Microbiology (31-140)
• Supervisor: RNDr. Lucie Benešová, Ph.D.
• Author: hidden - assigned by the advisor
• Date of registration: 27.11.2012
• Date of assignment: 27.11.2012
• Date of electronic submission: 13.08.2014
• Date of proceeded defence: 17.09.2014
• Opponents: Mgr. Martin Kuthan, Ph.D.

Preliminary scope of work

Karcinom pankreatu (KP) je velmi závažné onemocnění s pětiletým přežitím menším než 5 %. V současné době neexistuje žádný spolehlivý nástroj pro diagnózu KP v jeho časných stádiích. Pacienti v době diagnózy tak bývají často v pokročilém stádiu onemocnění a léčba nemívá výrazný účinek. Z těchto důvodů se klade stále větší důraz na nalezení vhodných molekulárních znaků, a to zejména pro zlepšení diagnózy a odhad prognózy. Jedním z takových nadějných znaků jsou miRNA. Jejich analýza v tkáni pankreatu je ale složitý proces. Hlavním důvodem je velmi malé množství vzorku získaného tenkojehlovou biopsií a dále pak samotný charakter pankreatické tkáně, ze které bývá úspěšnost molekulárně‑genetických vyšetření výrazně nižší v porovnání s ostatními tkáněmi. Dalším negativním faktorem je značná heterogenita tkáně, díky které se zastoupení nádorových buněk v různých částech vzorku často liší. A tak vhodná volba postupu izolace nukleových kyselin (NK) a následných analýz včetně kvantifikace nádorových buněk ve vzorku je pro správné stanovení hladin miRNA zcela klíčová.
Tato práce je zaměřená na optimalizaci celého postupu stanovení hladin miRNA z bioptických vzorků pankreatické tkáně zahrnující izolaci NK, kvantifikaci nádorových buněk pomocí stanovení mutací v genu KRAS, syntézu cDNA a analýzu hladin vybraných miRNA metodou qPCR. Dílčí kroky byly hodnoceny na základě množství získaných NK a výtěžku a kvality PCR produktů amplifikovaných z DNA a cDNA templátů. Funkčnost celého postupu pak byla ověřena analýzou genu KRAS, dvou miRNA (miR-21 a miR-10b) a referenčního genu RNU6b na souboru 110 bioptických vzorků s úspěšností 100 % (KRAS a miR-21), 99 % (RNU6b) a 93 % (miR-10b). Podařilo se tedy vyvinout a ověřit účinný postuppro rutinní kvantifikaci miRNA z bioptických vzorků tkáně pankreatu.

Preliminary scope of work in English

Pancreatic cancer (PC) is extremely severe malignant disease with a five-year survival of less than 5%. Currently there is no reliable tool for the diagnosis of PC in its early stages. At the time of clinical symptoms most patients are in an advanced stage of the disease and the treatment does not usually have a significant effect. For these reasons emphasis is gradually shifting to the search for the suitable molecular markers for improvement of the diagnosis and assessment of the survival prognosis with respect to a possibility of surgical treatment. MiRNA represent one of the most promising markers, although, their examination in pancreatic tissue is a complicated process. One of the reasons is the very small amount of the source material coming from a fine needle biopsy. A second cause of problems is the subtle character of the pancreatic tissue resulting in significantly lower yields of molecular genetic analysis when compared to other epithelial tissues. An additional negative factor is heterogeneity of the tissue resulting in disproportionate representation of tumor cells within the sample. A suitable choice of procedures for isolation of nucleic acids (NA) and subsequent analysis including quantification of tumor cells is critical for accurate evaluation of the miRNA levels.
This work is focused on optimization of the entire process from the initial acquisition of the sample from pancreatic tissue biopsy and isolation of NA, tumor cells quantification based on mutation detection in KRAS gene, cDNA synthesis and, finally, measurement of levels of selected miRNAs by qPCR. The partial steps were evaluated based on the quantities of nucleic acids and the yield and quality of the PCR products amplified from DNA and cDNA templates. The efficiency of the complete procedure was verified by a successful analysis of the KRAS gene, two miRNAs (miR-21 and miR-10b) and a reference gene RNU6b on a set of 110 biopsy samples with a success rate of 100% (KRAS and miR-21), 99% (RNU6b) and 93% (miR-10b). This confirmed a successful development and validation of an efficient procedure for reliable quantification of miRNAs from biopsy tissue samples of the pancreas applicable in routine clinical practice.