Epigenetická modifikace DNA nádorových buněčných linií v normoxii a hypoxii

• Thesis title in Czech: Epigenetická modifikace DNA nádorových buněčných ; linií v normoxii a hypoxii
• Thesis title in English: Epigenetic modification of DNA of tumor cell lines ; in normoxia and hypoxia
• Key words: acetylace histonů H3 a H4, hypoxie, neuroblastom, aktivita histonacetyltransferas a histondeacetylas, exprese proto-onkogenů c-Myc a N-Myc
• English key words: histone H3 and H4 acetylation, hypoxia, neuroblastoma, histoneacetyltransferases and histonedeacetylases activity, c-Myc and N-Myc expression
• Academic year of topic announcement: 2010/2011
• Thesis type: diploma thesis
• Thesis language: čeština
• Department: Department of Biochemistry (31-250)
• Supervisor: RNDr. Jitka Poljaková, Ph.D.
• Author: hidden - assigned by the advisor, waiting for guarantor's approval
• Date of registration: 24.10.2010
• Date of assignment: 19.01.2011
• Date of electronic submission: 23.08.2013
• Date of proceeded defence: 09.09.2013
• Opponents: Ing. Jana Hinďoš Hřebačková, Ph.D.

Preliminary scope of work

Neuroblastom je jedno z nejčastěji diagnostikovaných nádorových onemocnění u dětí. Tento rychle rostoucí solidní nádor je obvykle tvořen hypoxickými oblastmi, které vznikají jako důsledek nedostatečné a neuspořádané neovaskularizace. Hypoxií stresované buňky spouští transkripci mnoha genů nutných pro jejich přežití a naopak zastavují produkci těch proteinů, které pro přežití nepříznivých podmínek nezbytně nepotřebují. Adaptace buněk na hypoxické podmínky probíhá kromě jiného díky epigenetické regulaci metabolismu spojené s přestavbou chromatinu, zahrnující kromě methylace DNA také posttranslační modifikace histonů. Mezi nejvýznamější z nich se řadí acetylace lysinových zbytků histonů, která bývá spojována s rozvolněním vlákna DNA, usnadněným navázáním transkripčních faktorů a aktivací genové exprese. První část předkládané diplomové prácese zabývá změnami v acetylaci histonů H3 a H4 lidských neuroblastomových buněčných linií UKF-NB-3, UKF-NB-4, SH-SY5Y a SK-N-AS, kultivovaných paralelně při standardních kultivačních podmínkách a při nedostatku kyslíku (hypoxie, O₂ 1 %) po dobu 24 hodin, které jsou sledovány prostřednictvím metody Westernblot. Druhá část diplomové práce je věnována měření aktivity histonacetyltransferas a histondeacetylas, tedy enzymů, které se samotné acetylace histonů účastní, a studiu exprese proto-onkogenů N-Myc a c-Myc těchto buněčných linií v závislosti na kultivačních podmínkách (normoxie versus hypoxie po dobu 24 hodin). Experimentálně bylo zjištěno, že samotné kultivační podmínky v neuroblastomových nádorových buňkách ovlivňují acetylaci histonů H3 a H4 (v závislosti na buněčné linii). Kromě toho jsou podmínky kultivace spojené se změnou exprese proto-onkogenu N-Myc na úrovni proteinu. U tří buněčných linií charakterizovaných amplifikací či zmnožením onkogenu N-Myc hypoxické kultivační podmínky expresi tohoto onkogenu ještě více umocnily. Naproti tomu rozdíl v expresi onkogenu c-Myc v normoxii a hypoxii nebyl patrný u žádné ze čtyř studovaných neuroblastomových buněčných linií. Přesný vztah mezi oběma onkogeny doposud nebyl definován, ačkoliv se jejich funkce často překrývají.

Preliminary scope of work in English

Neuroblastoma is one of the most common cancer diseases diagnosed in children. This rapidly growing solid tumor is usually formed by hypoxic areas which arise as a consequence of inefficient and disorganized neovascularization. The cells stressed by hypoxia triggers transcription of many genes necessary for their survival, and conversely stop the production of proteins which are not necessarily needed for the survival in these severe conditions. The adaptation of cells to hypoxic conditions may appear due to the epigenetic regulation of metabolism associated with chromatin remodeling which involves the DNA methylation and also the posttranslational modifications of histones. Among the most important of these, there is the acetylation of lysine residues of histones associated with the DNA strands loosening, facilitated binding of transcription factors and the activation of gene expression. Thus, the first part of this study is concerned with changes in the acetylation of histones H3 and H4 of human neuroblastoma cell lines UKF-NB-3, UKF-NB-4, SH-SY5Y and SK-N-AS, cultured in parallel under standard culture conditions and in the absence of oxygen (hypoxia, 1% O₂) for 24 hours, which are studied by Western blot analysis. Thereupon, the activity of histone deacetylases and histonacetyltransferases, the enzymes that are themselves involved in histone acetylation, is measured and the expression of proto-oncogenes N-myc and c-Myc is studied within the same cell lines, depending on the culture conditions (normoxia versus hypoxia for 24 hours). It was found experimentally that the actual cultivation conditions in neuroblastoma tumor cells affect the acetylation of histones H3 and H4 (depending on the cell line). In addition, culture conditions are associated with the change in the expression of the N-Myc proto-oncogene on the protein level. In the three cell lines characterized by amplification or multiplication of N-Myc oncogene, the hypoxic culture conditions even magnified its expression. In contrast, the difference in the expression of c-Myc oncogene in normoxia and hypoxia was not observed in any of the four studied neuroblastoma cell lines. Although their functions often overlap, the exact relationship between both oncogenes has not been defined yet.