Exprese sTGFbeta RII-Fc-Jun z rekombinantního viru vakcinie

• Thesis title in Czech: Exprese sTGFbeta RII-Fc-Jun z rekombinantního viru vakcinie
• Thesis title in English: Expression of sTGFbeta RII-Fc-Jun from recombinant vaccinia virus
• Key words: virus vakcinie, TGFbeta, TbetaRII, Fc IgG1 fúzní proteiny, Jun
• English key words: vaccinia virus, TGFbeta, TbetaRII, Fc IgG1 fusion proteins, Jun
• Academic year of topic announcement: 2009/2010
• Thesis type: diploma thesis
• Thesis language: čeština
• Department: Department of Genetics and Microbiology (31-140)
• Supervisor: RNDr. Šárka Němečková, DrSc.
• Author: hidden - assigned and confirmed by the Study Dept.
• Date of registration: 15.12.2008
• Date of assignment: 26.05.2010
• Date of electronic submission: 01.06.2010
• Date of proceeded defence: 01.06.2010
• Opponents: RNDr. Hana Španielová, Ph.D.

Preliminary scope of work

Exprese sTGFbetaRII-Fc-Jun z rekombinantního viru vakcinie

TGFbeta má při karcinogenezi dvojí roli. V počátku slouží jako nádorový supresor, během růstu nádoru se však jeho funkce může změnit na nádorový promotor a buňky nádoru i jeho okolí pak produkují velké množství TGFbeta. Tento nádorový TGFbeta posky-tuje vhodné prostředí pro růst a šíření nádoru. Jedním ze způsobů, jak kontrolovat růst nádoru a metastáze, je blokování signální dráhy TGF? v pokročilých stádiích karcino-geneze.
Připravili jsme rekombinantní virus vakcinie P13 exprimující rozpustný receptor typu II pro TGFbeta fúzovaný k Fc fragmentu IgG a k fragmentu Jun (sTbetaRII-Fc-Jun) pod kontrolou H5 nebo E/L promotoru. Tento sTbetaRII-Fc-Jun by měl zvýšit účinek protiná-dorové virové vakcíny exprimující SigE7LAMP, tato vakcína se zkoumá pro využití při terapii karcinomů cervixu asociovaných s HPV-16.
Zkoumali jsme vazbu receptoru sTbetaRII-Fc-Jun na protein G, kdy jsme pomocí imunoblotu prokázali, že fragment Jun a fragment sTbetaRII nebrání fragmentu Fc ve vaz-bě na protein G.
Pomocí SDS-PAGE a imunoblotu jsme charakterizovali protein se sTbetaRII-Fc-Jun. sTbetaRII-Fc-Jun se ve velkém množství uvolňoval do média a v buněčných lyzátech jsme ho detekovali méně než receptoru sT?RII. Exprese sTbetaRII-Fc-Jun byla silnější pod kontrolou E/L promotoru než pod kontrolou H5 promotoru.
Dvojité rekombinanty P13-SigE7LAMP-H5-sTbetaRII-Fc-Jun a P13-SigE7LAMP-E/L-sTbetaRII-Fc-Jun vyvolávaly T buněčnou imunitní odpověď specifickou pro E7 peptid a VACV peptid, která byla stanovena pomocí testu ELISPOT pro IFN-gama.
Při in vivo pokusech jsme nepozorovali vliv koexprese sTbetaRII-Fc-Jun na účinnost virové vakcíny P13-SigE7LAMP-TK-.

Preliminary scope of work in English

Expression of sTGFbetaRII-Fc-Jun from recombinant vaccinia virus

TGFß has a biphasic role in tumorigenesis. In early phases it acts as tumor sup-pressor. However, in late phases when cells have escaped selectively from the antimito-genic response of TGFß, it may act as a promoter of tumor progression and invasion. One way of control tumor formation and progression is blocking of TGFß signalling pathways in late phases of tumorigenesis.
We have constructed recombinant vaccinia virus P13 expressing soluble TGFbeta type II receptor fused with the Fc fragment of IgG1 and with Jun fragment (sTbetaRII-Fc-Jun). This sTbetaRII-Fc-Jun is supposed to increase the effect of antitumor vaccinia virus vaccine expressing SigE7LAMP, which is investigated for the treatment of the HPV-16 associated cervical cancer.
Binding of sTbetaRII-Fc-Jun to protein G were tested by SDS-PAGE and by im-munoblotting. We found that Jun fragment and sTbetaRII fragment do not block Fc bind-ing site for protein G.
sTbetaRII-Fc-Jun was characterised using SDS-PAGE and immunoblot analysis. We observed that the amount of sTbetaRII-Fc-Jun was higher in cell supernatans of in-fected cells in comparison to cell lysates. In cell lysates we observed higher amount of sTbetaRII than sTbetaRII-Fc-Jun. The expression of sTbetaRII-Fc-Jun was stronger under the control of E/L promoter than under the control of H5 promoter.
The T cell response was determined by ELISPOT-IFN-gama assay. We observed T cell response against E7 and VACV antigen induced in mice by immunization with P13-SigE7LAMP-H5-sTbetaRII-Fc-Jun and P13-SigE7LAMP-E/L-sTbetaRII-Fc-Jun.
We did not observe the effect of sTbetaRII-Fc-Jun coexpression on the therapeutic anti-tumor effect of immunization with P13-SigE7LAMP-TK-.