Enzymová syntéza a studium vlastností DNA nesoucí elektron-donorní nebo elektron-akceptorní skupiny na nukleobázích

• Thesis title in Czech: Enzymová syntéza a studium vlastností DNA nesoucí elektron-donorní nebo elektron-akceptorní skupiny na nukleobázích
• Thesis title in English: Enzymatic synthesis and study of the properties of DNA bearing electron-donor or electron-acceptor groups on nucleobases
• Key words: DNA, oligonukleotid, trifosfát, modifikace, enzym, PEX, PCR, biofyzikální vlastnosti
• English key words: DNA, oligonucleotide, triphosphate, modification, enzyme, PEX, PCR, biophysical properties
• Academic year of topic announcement: 2024/2025
• Thesis type: Bachelor's thesis
• Thesis language: čeština
• Department: Department of Biochemistry (31-250)
• Supervisor: Ing. Veronika Raindlová, Ph.D.
• Author: hidden - assigned and confirmed by the Study Dept.
• Date of registration: 13.01.2025
• Date of assignment: 13.01.2025
• Confirmed by Study dept. on: 03.02.2025
• Study form: full-time
• Date of electronic submission: 16.05.2025
• Date of proceeded defence: 03.06.2025
• Opponents: Ing. Ondřej Baszczyňski, Ph.D.
• Advisors: prof. Ing. Michal Hocek, CSc., DSc.

Preliminary scope of work

Modifikované DNA oligonukleotidy mohou být připravovány chemicky nebo enzymaticky. Oba přístupy mají své specifické výhody i nevýhody. Chemická syntéza je v současné době limitována vysokými náklady a často vyžaduje hlubší technické zkušenosti. Klasickou enzymovou syntézou lze běžně připravit piko- či nanomolární množství DNA, které je dostačující ke studiu biofyzikálních vlastností. Vliv a specifické interakce nejrůznějších chemických modifikací ve velkém žlábku DNA jsou dlouhodobě a systematicky zkoumány. Hlavním cílem těchto rozsáhlých studií je zejména pochopení různých biologických procesů a bioortogonálních reakcí makromolekul.
Z tohoto důvodu jsme se rozhodli připravit nejprve čtyři různě modifikované 2´-deoxynukleosid trifosfáty nesoucí elektron-donorní nebo elektron-akceptorní substituenty v pozici 5 u cytidinu a v pozici 7 u 7-deazaadenosinu (dC^OMeTP, dC^DOxTP, dA^FTP, dA^2FTP). Následně pak připravit takto modifikované DNA enzymovou syntézou (PEX, PCR) za využití různých DNA polymeráz spadající do rodiny archeálních B DNA polymeráz. Zároveň bude pro účely této bakalářské práce exprimována DNA polymeráza KOD(exo-).
Cílem práce tedy bude enzymová syntéza modifikovaných DNA pomocí různých DNA polymeráz, porovnání procesivity všech studovaných polymeráz, jejich schopnost inkorporovat modifikovaný nukleotid do DNA a zároveň studium vlastností těchto DNA.

Preliminary scope of work in English

Modified DNA oligonucleotides can be prepared chemically or enzymatically. Both approaches have their specific advantages and disadvantages. Chemical synthesis is currently limited by high costs and often requires in-depth technical expertise. Classical enzymatic synthesis can routinely prepare pico- or nanomolar quantities of DNA that are sufficient to study biophysical properties. The effect and specific interactions of various chemical modifications in the large DNA groove have been studied systematically for a long time. In particular, the main goal of these large-scale studies is to understand various biological processes and bioorthogonal reactions of macromolecules.
For this reason, we decided to first prepare four differently modified 2′-deoxynucleoside triphosphates bearing electron-donor or electron-acceptor substituents at position 5 of cytidine and at position 7 of 7-deazaadenosine (dC^OMeTP, dC^DOxTP, dA^FTP, dA^2FTP). Subsequently, the modified DNA will be prepared by enzymatic synthesis (PEX, PCR) using various DNA polymerases belonging to the family of archaeal B DNA polymerases. At the same time, the DNA polymerase KOD(exo-) will be expressed for the purpose of this bachelor thesis.
Thus, the aim of this thesis will be the enzymatic synthesis of modified DNAs using different DNA polymerases, comparison of the processivity of all studied polymerases, their ability to incorporate the modified nucleotide into DNA and also the study of the properties of these DNAs.