Role Myotubularinu 9 (MTMR9) a jeho vazebných partnerů MTMR6 a MTMR8 v makropinocytóze

• Thesis title in Czech: Role Myotubularinu 9 (MTMR9) a jeho vazebných partnerů MTMR6 a MTMR8 v makropinocytóze
• Thesis title in English: Exploring the Role of Myotubularin 9 (MTMR9) and its Binding Partners MTMR6 and MTMR8 in Macropinocytosis
• Key words: MTMR, myotubularin, makropinocytóza, fosfoinositidy
• English key words: MTMR, myotubularin, macropinocytosis, phosphoinositide
• Academic year of topic announcement: 2023/2024
• Thesis type: diploma thesis
• Thesis language: čeština
• Department: Department of Cell Biology (31-151)
• Supervisor: Mgr. Lenka Doubravská, Ph.D.
• Author: hidden - assigned and confirmed by the Study Dept.
• Date of registration: 31.10.2023
• Date of assignment: 31.10.2023
• Confirmed by Study dept. on: 06.11.2023

Preliminary scope of work

Makropinocytóza je jev, který buňky používají k získání velkého objemu extracelulární tekutiny a v ní obsažených makromolekul (tzv. buněčné pití). Vznikají tak velké váčky nazývané makropinocytozómy.
MTMR9, MTMR6 a MTMR8 jsou molekuly patřící do rodiny myotubularinu podobných proteinů. Jde o enzymy s fosfoinositid fosfatázovou aktivitou, které se podílejí na regulaci těchto minoritních lipidů. MTMR6 a MTMR8 jsou aktivní fosfatázy, jejichž substrátem je fosfatidylinositol 3-fosfát PI(3)P a fostatidyl inositol 3,5-bisfosfát PI(3,5)P₂. Oba tyto lipidy se podílejí na váčkovém transportu uvnitř buněk a přispívají tak k membránové rovnováze. MTMR9 je neaktivní enzym schopný vázat své aktivní interakční partnery MTMR6/8, přispívat k jejich stabilitě a potencovat jejich enzymatickou aktivitu.
Během makropinocytózy hrají důležitou roli další fosfoinositidy, a to PI(4,5)P₂ a PI(3,4,5)P₃, které slouží jako membránové přístavy pro řadu proteinů podílejících se na tomto jevu. Také PI3P byl popsán jako fosfoinositid účastnící se makropinocytózy. Caenorhabditis elegans s mutovanými ortology genů pro MTMR6 a MTMR9 (mtm-6 a mtm-9) má „problémy s pitím“ podobně jako lidská epidermoidní buněčná linie A431 se sníženou expresí genů pro MTMR6 a MTMR9 (Maekawa et al., 2013).
Všechny zmíněné myotubulariny pozorujeme v „rufflující“ plazmatické membráně, což je místo, kde se v buňce děje makropinocytóza. HeLa buněčné linie s deletovanými jednotlivými myotubulariny (MTMR KOs) jsou méně transfekovatelné i transdukovatelné, což je možné vysvětlit změnami v makropinocytóze. Naše předběžná data ukazují rozdíly v lokalizaci molekul ovlivňujících makropinocytózu (aktivní RAC1 protein nebo PI(3,4,5)P₃ lipid) u zmíněných buněk ve srovnání s kontrolními. Cílem práce bude zjistit, zda-li je schopnost makropinocytovat snížena u MTMR KO buněk a zda-li jsou aktivní MTMR6 a MTMR8 v tomto ději redundantní.
Diplomová práce bude spočívat ve vytvoření nových MTMR KO linií odvozených od RPE-1 buněk (imortalizovaná linie retinálních pigmentových epiteliálních buněk), které už byly úspěšně popsány jako model pro studium makropinocytózy (Schink et al., 2021). Obě sady buněčných linií poslouží k měření pohlceného dextranu, který se běžně používá jako „buněčný nápoj“. Míra intracelulárního dextranu bude stanovena průtokovou cytometrií a monitorována pomocí mikroskopických přístupů.

Preliminary scope of work in English

Macropinocytosis is a cellular process by which cells engulf extracellular fluid and macromolecules by forming large, non-specific, endocytic vesicles called macropinosomes.
MTMR9, MTMR6, and MTMR8 belong to the myotubularin-related protein family, which are phosphoinositide phosphatases involved in the regulation of phosphoinositide signalling. MTMR6 and MTMR8 are active phosphatases known to dephosphorylate phosphatidylinositol 3-phosphate PI(3)P and phosphatidylinositol 3.5-bisphosphate PI(3.5)P2, which are important regulators of membrane trafficking and cellular homeostasis. MTMR9 is a phosphatase dead member of this protein family and interacts with active partners to potentiate their activity.
During the process of macropinocytosome formation PI(4.5)P2 and PI(3.4.5)P3 play important roles as membrane harbours for various proteins that are involved in this phenomenon. Nevertheless, there is evidence that even PI(3)P could participate in macropinocytosome progression. Caenorhabditis elegans mutants defective in MTMR6 and MTMR9 orthologs (mtm-6 and mtm-9) have “drinking problems” similar to the human epidermoid carcinoma cell line A431 after MTMR6 or MTMR9 knock-down (Maekawa et al., 2013).
We are able to observe all mentioned MTMRs in the ruffling membranes which is the site where macropinocytosis takes place within the cells. HeLa-derived cell lines with deleted individual MTMRs are much less transfectable and transducible which could be explained by defective macropinocytosis. Our preliminary data show differences in the localization of active RAC1 protein and PI(3.4.5)P3 probe in control and MTMR-deleted cells. We want to determine whether macropinocytosis is reduced in MTMR knock-out cell lines (MTMR KOs) and whether the active phosphatases MTMR6 and MTMR8 are redundant in this process.
The diploma project will be based on the generation of new MTMR KOs derived from RPE-1 cells (hTERT-immortalised retinal pigment epithelial cells). We want to be sure that our observations are not unique only to HeLa cells and the RPE-1 cell line has already been successfully used to study macropinocytosis (Schink et al., 2021). Having obtained control and KO cell lines, we will measure the uptake of dextran, which is a common "drinking cargo". The level of uptake will be assessed by flow cytometry and monitored by microscopy.