The role of secondary metabolites in microbial community interactions

• Thesis title in Czech: Role sekundárních metabolitů pri interakcích v mikrobiálních symbiotických spoločenstvech
• Thesis title in English: The role of secondary metabolites in microbial community interactions
• Key words: houby, epigenetika, antiherbivorní látky, nové léčiva, HPLC, LC-MS
• English key words: fungi, epigenetics, antiherbivoric compounds, novel drugs, HPLC, LS-MS
• Academic year of topic announcement: 2020/2021
• Thesis type: dissertation
• Thesis language: angličtina
• Department: Department of Genetics and Microbiology (31-140)
• Supervisor: Mgr. Miroslav Kolařík, Ph.D.
• Author: hidden - assigned by the advisor
• Date of registration: 02.10.2020
• Date of assignment: 13.10.2020

References

Brakhage, Axel A., and Volker Schroeckh. "Fungal secondary metabolites–strategies to activate silent gene clusters." Fungal Genetics and Biology 48.1 (2011): 15-22
Xiao, Jian, et al. "Secondary metabolites from the endophytic Botryosphaeria dothidea of Melia azedarach and their antifungal, antibacterial, antioxidant, and cytotoxic activities." Journal of agricultural and food chemistry 62.16 (2014): 3584-3590.
Miceli, Marco, et al. "Natural compounds in epigenetics: a current view." Food and chemical toxicology 73 (2014): 71-83.
Rohlfs, Marko, and Alice CL Churchill. "Fungal secondary metabolites as modulators of interactions with insects and other arthropods." Fungal Genetics and Biology 48.1 (2011): 23-34.
Hammer, Tobin J., and M. Deane Bowers. "Gut microbes may facilitate insect herbivory of chemically defended plants." Oecologia 179.1 (2015): 1-14.
Miceli, M., Bontempo, P., Nebbioso, A. and Altucci, L., 2014. Natural compounds in epigenetics: a current view. Food and chemical toxicology, 73, pp.71-83.
Veselská, T. and Kolařík, M., 2015. Application of flow cytometry for exploring the evolution of Geosmithia fungi living in association with bark beetles: the role of conidial DNA content. Fungal ecology, 13, pp.83-92.

Preliminary scope of work

Úvod
Život na Zemi sa vyznačuje pozoruhodným množstvom symbiotických a vysoko rafinovaných vzťahov medzi organismy. Houby, jako účastníci symbiotických vztahů, často produkujú bioaktívne molekuly (např. sekundární metabolity) ovplyvňujúce symbionta prípadne modulující prostředí, do kterého je symbioza zasazena. Studium takovýchto vztahů není jednoduché, protože úzká koevoluce mezi oběma symbiotickými partnery vede k tomu, že produkce bioaktivních látek houbou je u idukována pouze jako reakce na konkrétní podnět (Brakhage et al. 2011). Takovým stimulem může být nejen kontakt se symbiotickým partnerem, ale také kontakt s dalšími partnery vstupujícími do symbiotických vztahů (např. dalšími mikroorganismy) nebo environmentálními faktory. Mezi takové faktory může patřit například změna fyzikálních čí nutričních podmínek nebo speficické látky vyskytující se v prostředí symbiotického vztahu (Xiao et al. 2014). Pro pochopnení celé šíře interakcí je mezi symbiotickými partnery ve společenstvách nezbytné objasnění mechanismu, kterým dochází ke spustění expresse cílových genů. Již nyní je zřejmé, že některé látky vyskytující se v prostředí mohou fungovat jako epigenetické modifikátory a mohou tak spustit expresi drah vedoucích k produkci sekundárních metabolitů u houbového symbionta.(Miceli et al. 2014). Kromě mechanismu, jakým je produkce látek spuštěna je žádoucí také zjitit jakou roli hrají metabolity vylučované houbovým partnerem v symbiotickém vztahu. Jedná se často o sekundární metabolity s antimikrobiální, antihelmitickou, herbicifní, pesticidní aktivitu, která pomáhá potlačit konkurenty nebo patogeny symbiotického partnera či samotné houby (Rohlfs et Churchill 2011). V neposlední řadě může tento výzkum vést k objavu zajímavých biokativních látek, protože z důvodu nízké produkce metabolitů bez přítomnosti specifického stimulu jde ve většině případů o houbyz hlediska produkce sekundárních metabolitů neprosdudované.
Výber modelových symbiotických spoločenstev
Bejlomorky (čeľaď: Cecidomyiidae) patria k vysoce diverzifikovaným skupinám hmyzu (Hebert et. al. 2016). Väčšina z nich vytvára na rastlinách hálky. Minoritnú časť bejlomoriek predstavujú takzvané ambroziové bejlomorky, které jsou unikátne tím, že pestujú vo svojich hálkach huby, které pravdepodobne slúžia ako potrava pre vyvíjajúce sa larvy (Veenestra et al. 2019). Analogicky symbiotický vztah můžeme lze nalézt také u podkorního hmyzu (kůrovců) z čeledi Scolytidae. Část kůrovců se také vyprofilovala jako takzvaní ambózioví kůrovci, pro které také představují houby obohacení jídelníčku vyvíjejích se larev. Koevoluce mezi oběma symbiotickými partnery dokonce vedla u kůrovců ke zvětšení houbových spor, které se tak staly nutrričně zajímavější pro vyvíjející se larvy hmyzu (Veselská 2015). Kromě toho je možné, že houbové symbionty mají u obou skupin schopnosť detoxikáciesekundárnych metabolitov rastlín v hálkach či dřevě, ktoré by mohli byť pre vyvíjajúce sa larvy rizikové (Huggins 2008). Detoxifikace prostředí má zásadní význam pri formovaní a schopnosti hmyzu živiť sa chemicky chránenou rastlinnou biomasou (Hammer 2015). Proto tuto schopnost využívá celý řada herbivorního hmyzu. Jedním z nich je také herbivórní hmyzu rodu Tischeria, živící se parnechymem listů v procesu zvaném minování.
Ciele práce
i) Navození produkce sekundárních metabolitů u houbových symbiontů vybraných modelových společenstev (bejlomorek, kůrovců a housek rodu Tischeria)
ii) Objasnění mechanismus, kterým dochází ke spuštění produkce těchto metabolitů pomocí NGS technik
iii) Vyšetření biologické aktivity nalezených látek a jejich role v symobiotickém vztahu
iv) Vyšetření vlivu houbového partnera pro detoxifikaci antiberbirovních látek
Metodika analýzy sekundárnych metabolitov
Výskum symbiotických vztahů mezi podkorním a heribivorním hmyzem a jejich houbovými symbionty patří mezi hlavní výzumným projekty laboratoře Genetiky a sekundárního metabolismu hub AV ČR, v které bude výzkum probíhat. Větíšina vybaných symbiotických společenstev tak již byla charakterizována v předešlých projektech (XX). K dispozici proto bude rozsáhlá sbírka houbovách kultur, včetně kultur se symbiozou asociovaných mikroorganismů. Neprostudované je z toho hlediska pouze společenstvo bejlomorek, jehož charakterizace proběhne pomocí NGS a kultivačních technik v příštím roce. Získané kmeny houbových symbiontů budou ko-kutivované společně s vybranými kmeny dalších organismů a vybranými antiherbivórními látkami (přirozeně se vyskytující v prostedí symbiózy) či epigenetickými modifikátormi v třepaných kulturách. Během kultivace bude monitorováno spektrum metabolitov použitím LC-MS přístroje v supernatantu i houbové biomase pomocí jednoduche metody mikroextrakce. Vybrané metabolity, které byly indukováné některými z efektorů, budou purifikovány pomocí preparativního HPLC a charakterizována bude jejich chemická struktura pomoci NMR spektrometrie. Následne bude u charakterizovaných metabolitů zjišťována jejich biologická aktivita. V laboratoři je možné rutinně zjišťovat cytotoxickou ( spolupráce s kaderou buněčné biologie UK), antimokrobiální, antihelmintickou aktivitu nebo schopnosti metabolitů rozrušovat bakteriální biofilmy. Za použitím NGS dat (sekvenovány budou genomy včetně metylomů) budou identifikovány genové klastry vedoucí k produkci nalezených metabolitů a diskutován bude mechanismus, jakým dochází ke spuštění těchto drah.

Preliminary scope of work in English

Introduction
Life on Earth is characterized by a remarkable number of symbiotic and highly complex relationships between organisms. Fungi, as participants in symbiotic relationships, often produce bioactive molecules (eg secondary metabolites) that affect the symbionts or modulate the environment in which the symbiosis is embedded. The study of such relationships is not easy, because the close coevolution between the two symbiotic partners leads to the fact that the production of bioactive substances by the fungus is induced only in response to a specific stimulus (Brakhage et al. 2011). Such a stimulus can be not only contact with a symbiotic partner, but also contact with other partners entering into symbiotic relationships (eg other microorganisms) or environmental factors. Such factors may include, for example, a change in physical or nutritional conditions or a specific substance occurring in a symbiotic relationship environment (Xiao et al. 2014). To understand the full range of interactions between symbiotic partners in communities, it is necessary to elucidate the mechanism by which the expression of target genes is triggered. It is already clear that some substances present in the environment can function as epigenetic modifiers and can thus trigger the expression of pathways leading to the production of secondary metabolites in the fungal symbiont (Miceli et al. 2014). In addition to the mechanism by which the production of substances is triggered, it is also desirable to determine the role played by metabolites secreted by the fungal partner in the symbiotic relationship. These are often secondary metabolites with antimicrobial, anthelmitic, herbicidal, pesticidal activity that helps to suppress competitors or pathogens of the symbiotic partner or the fungus itself (Rohlfs et Churchill 2011). Last but not least, this research may lead to the discovery of interesting bioactive substances, because due to the low production of metabolites without the presence of a specific stimulus, these are in most cases fungi from the point of view of secondary metabolite production.
Aims of the work
i) Induction of production of secondary metabolites in fungal symbionts of selected model communities (beetles, bark beetles and the insect genus Tischeria)
ii) Elucidatin of the mechanism by which the production of these metabolites is triggered
iii) Examination of the biological activity of found substances and their role in the symbiotic relationship
iv) Investigation of the influence of the fungal partner on the detoxification of antiberbiridal substances
Methods
Research of symbiotic relationships between heribivorous insects and their fungal symbionts is one of the main research projects of the Laboratory of Genetics and Secondary Metabolism of Fungi of the ASCR, in which the research will take place. Most of the selected symbiotic communities have already been characterized in previous projects. Therefore, an extensive collection of fungal cultures will be available, including cultures with a symbiosis of associated microorganisms. The obtained strains of fungal symbionts will be co-cultivated together with selected strains of other organisms and selected antiherbivorous substances (naturally occurring in the environment of symbiosis) or epigenetic modifiers in shaken cultures. During cultivation, the spectrum of metabolites will be monitored using an LC-MS instrument in both the supernatant and the fungal biomass using a simple microextraction method. Selected metabolites that have been induced by some of the effectors will be purified by preparative HPLC and their chemical structure will be characterized by NMR spectrometry. Subsequently, the biological activity of the characterized metabolites will be determined. In the laboratory, it is possible to routinely determine cytotoxic, antimocrobial, anthelmintic activity or the ability of metabolites to disrupt bacterial biofilms. Using NGS data (genomes including methylomas will be sequenced), gene clusters leading to the production of found metabolites will be identified and the mechanism by which these pathways are triggered will be discussed.