Vliv mikrobiomu na patogenezi střevních onemocnění

• Thesis title in Czech: Vliv mikrobiomu na patogenezi střevních onemocnění
• Thesis title in English: The effect of microbiota on pathogenesis of gut diseases
• Key words: Crohnova choroba, ulcerózní kolitida, Candida, environmentální DNA, sekvenování nové generace, metabarcoding
• English key words: Crohn's disease, ulcerative colitis, Candida, environmental DNA, next generation sequencing, metabarcoding
• Academic year of topic announcement: 2015/2016
• Thesis type: diploma thesis
• Thesis language: čeština
• Department: Department of Botany (31-120)
• Supervisor: Mgr. Miroslav Kolařík, Ph.D.
• Author: hidden - assigned by the advisor
• Date of registration: 12.10.2015
• Date of assignment: 21.12.2015
• Date of electronic submission: 02.05.2017
• Date of proceeded defence: 06.06.2017
• Opponents: Ing. Tomáš Hudcovic, Ph.D.
• Advisors: MUDr. Miloslav Kverka, Ph.D.

Preliminary scope of work

Výchozí předpoklady/cíle:
Poslední výzkumy ukazují, že nejen bakterie, ale i houby osidlující trávicí trakt mohou ovlivňovat vývoj a kurz gastrointestinální onemocnění. Naznačují to i houbové protilátky, které jsou běžně nacházeny v krvi pacientů s IBD. Jednou z hypotéz je změna ve složení střevní mikrobioty nemocí nebo antimikrobiální léčbou, jenž pak může narušit střevní bariéru a iniciovat slizniční i systémovou imunitní odpověď, a tak výrazně ovlivnit střevní fyziologii. Cílem diplomové práce je popsat rozdíly ve složení střevní mykobioty v bioptických vzorcích pacientů s kolorektálním karcinomem (CRC) a bioptických i fekálních vzorcích asociovaných s nespecifickými střevními záněty (IBD). Dalším cílem je najít korelaci mezi složením mykobiomu a houbovými protilátkami v séru pacientů s IBD oproti kontrolám. V neposlední řadě si kladu za cíl analyzovat lokální prostředí vznikající působením kmenů hub asociovaných s uvedenými onemocněními a jejich složek na imunitní a epiteliální buněčnou odpověď použitím in vivo experimentů na buněčných kulturách.
Materiál a metodika:
Zdroje. Byl získán relativně velký počet vzorků zdravých a nemocných jedinců a to především z důvodu interindividuální variability ve složení střevního mykobiomu. Objekty byly pacienti s IBD, Crohnovou chorobou a ulcerózní kolitidou, a také pacienti s kolorektálním karcinomem pod různými schématy léčby. Vzorky jsou buď fekální, nebo bioptické odběry.
Způsob. Celková DNA bude pro techniky molekulární biologie extrahována komerčně dostupnými kity zahrnujícími rozbíjení vzorku keramickými kuličkami (MasterPure™ Complete DNA, FastPrepTM Lysing Matrix Y). Sekvenování další generace ITS rDNA amplifikovaných knihoven střevního mykobiomu bude použito k identifikaci složení daných komunit. Statisticky významné změny v četnosti jednotlivých houbových taxonů budou stanoveny pomocí metody Metastats. Sekvenování bude prováděno použitím nejrecentnějších optimalizovaných protokolů na platformě MiSeq. Data získaná ze sekvenace budou procesovány pomocí softwarového balíčku Qiime.
Na základě výsledků z analýz sekvenačních dat budeme kultivovat vybrané druhy hub asociované s patologií, které budou dále používány pro in vitro experimenty. Vybrané vzorky stolice budou použity pro specifickou s nemocí asociovanou izolaci hub a jejich kultivaci. Misky se inkubují aerobně i anaerobně v 37 °C. Jednotlivé inkubované, morfotypizované a osekvenované kolonie přeočkujeme na Petriho misky. Do deseti zástupců bude kultivováno ve větších dávkách, zprocesováno pro hustý lyzát pomocí French presu, lyofilizováno a dále analyzováno in vitro.
Ke studiu základních imunitních a buněčných odpovědí vůči různým houbovým stimulantům budeme kultivovat epiteliální a imunitní buňky s různými houbovými antigeny a změříme jejich pro- nebo proti-zánětlivou odpověď. Efekt na produkci cytokinů a buněčnou proliferaci a expresi bude určen pomocí enzyme-linked imunosorbent assay (ELISA) nebo kolorimetrické analýzy (NO).
Otázky:
1. Liší se střevní mykobiom jedinců trpících IBD a CRC oproti zdravým kontrolám?
2. Jsme schopni definovat takzvané „markerové druhy“ pro jednotlivé diagnózy?
3. Jsou tyto druhy/kmeny kultivovatelné?
4. Jak metabolismus druhů/kmenů asociovaných s patogenezí moduluje lokální prostředí střeva?
5. Jaké je jejich působení na imunitní a epiteliální buněčnou odpověď?
6. Existuje korelace mezi složením mykobiomu a houbovými protilátkami v séru pacitentů s IBD?

Základní časový harmonogram:

zimní semestr šk. roku 2015/2016: izolace DNA z párových vzorků CRC, PCR houbových a bakteriálních destiček
letní semestr šk. roku 2015/2016: finalizace molekulárních metod, zaslání destiček k sekvenaci, vyhodnocení dat, první kultivační pokusy
zimní semestr šk. roku 2016/2017: kultivace a in vitro analýzy
letní semestr šk. roku 2016/2017: dotažení a vyhodnocení výsledků

Preliminary scope of work in English

Gut microbiota has been recently considered an important factor for development of various illnesses including inflammatory bowel disease – ulcerative colitis and Crohn´s disease, and colorectal cancer. The aim of the diploma thesis will be to describe differences between healthy and diseased microbiota. The work will be based on the analysis of microbiota associated with clinical samples using high-trough put sequencing approach. Selected microbes will be also cultured and their physiologic and metabolic features will be characterized. Moreover, their effect on cellular response will be studied in epithelial and immune cell cultures