Comparative methods for studying adaptive traits of fungal symbionts

• Thesis title in Czech: Komparativní metody pro studium adaptivních znaků houbových symbiontů
• Thesis title in English: Comparative methods for studying adaptive traits of fungal symbionts
• Key words: houby, symbióza, patogen, mutualista, komparativní metody, adaptace, velikost genomu, enzymy, Geosmithia, Pseudogymnoascus
• English key words: fungi, symbiosis, pathogen, mutualist, comparative methods, adaptations, genome size, enzymes, Geosmithia, Pseudogymnoascus
• Academic year of topic announcement: 2013/2014
• Thesis type: dissertation
• Thesis language: angličtina
• Department: Department of Botany (31-120)
• Supervisor: Mgr. Miroslav Kolařík, Ph.D.
• Author: hidden - assigned by the advisor
• Date of registration: 14.10.2013
• Date of assignment: 15.11.2013
• Date of electronic submission: 30.03.2022
• Date of proceeded defence: 19.05.2022
• Opponents: Dr. Kerstin Voigt, Ph.D.

Preliminary scope of work

Úvod
Během ekologické speciace dochází k adaptaci druhů na nové prostředí. Nový typ substrátu, vazba na jiný druh hostitle či patogenicita jsou nejčastější ekologické skoky u hub. Produkce extracelulárních enzymů, biochemického složení buněk a produkce allelopatických látek a toxinů jsou znaky, které reagují na tyto evoluční změny a jsou částečně studovatelné v podmínkách in vitro. Lze předpokládát, že poznáním těchto znaků lze odhalit ty, které představují adaptace na danou ekologickou roli a podléhají selekci. Hledání adaptivních znaků, je kromě otázek základního výzkumu, zásadní pro odhalování mechanismů patogenicity. V současné době je pouze minimum podobných srovnávacích studií, a cílem práce je úkázat použitelnost tohoto přístupu na dvou skupinách hub. V rámci disertační práce budou na základě znalosti o fylogenetické příbuznosti, rozšíření, diverzitě, taxonomii a ekologii studovaných organismů hledány adaptivní znaky, které hrály důležitou roli v jejich evoluci. Jako modelové organismy byly vybrány dvě skupiny hub, které zahrnují druhy voloně žijící, tak příbuzné druhy žijící v různých typech symbióz, od komenzálismu po mutualismus a parazitismus.Tyto skupiny zahrnují symbioty podkorního hmyzu (ophiostomatální houby, rod Geosmithia) a půdní saprofyty a parazity z rodu Geomyces.
Ophiostomatální houby zahrnují saprotrofní druhy žijící většinou v symbiose s kůrovci (Coleoptera: Scolytinae).Jedná se o mutualistický vztah, kdy brouk houbu využívá jako doplněk stravy a v boji proti rostlinné obraně a houba je broukem přenášena a inokulována na nový substrát. V případě druhů O. ulmi a O. novo-ulmi došlo k přechodu k patogennímu způsobu života. Tyto houby způsobující Dutch elm desease jsou odpovědné za úhyny jilmů v Evropě a Americe. Další odvozenou strategií těchto hub je přechod k obligátní symbiose s ambrosiovými brouky [1]. Ambrosiový brouci vytvářejí požerek v na živiny chudém dřevě, kde pěstují svou specifickou ambrosiovou houbu, na které jsou potravně zcela závislí. Ambrosiové houby vykazují obdobný fenotyp způsobený konvergentní evolucí. Jedná se především o schopnost přecházet do kvasinkovitého růstu (ambrosiová fáze), zjednodušení komplexity konidioforu a tvorbu velikých, sférických konidií [2]. Stále častěji je u širokého spektra organismů nacházena korelace mezi velikostí genomu a velikostí buňky (souhrnně v [3]). Je tedy možné, že i u ambrosiových hub došlo v evoluci ke zvětšování genomu vlivem selekce na tvorbu větších spor (zvětšení poměru protoplast/buněčná stěna). Podobnou ekologickou distribuci nacházíme u rodu Geosmithia. Část druhů jsou kromě vazby na podkorní hmyz nalézany na rozličných rostlinných subtrátech, další druhy žijí v těsné symbioze s podkorním hmyzem a nalézáme zde jak druhy s širokým tak úzkým spektrem přenačů. Několik druhů žije jako pravé ambrosiové houby a jeden druh je rostlinný patogen (citace).
Rod Geomyces reprezentují psychrofilní druhy žijící v půdách chladných oblastí a v jeskynních prostorách. Rod dále zahrnuje keratinofilní druh G. pannorum [4], který je i příležitostným patogenem, a G. destructans, který byl rozpoznán jako pathogen způsobující syndrom bílého nosu (white-nose syndrom, WNS) u hibernujících netopýrů. Syndrom byl poprvé objeven v roce 2006 v USA ve státě New York, odkud se rychle rozšířil přes celou Severní Ameriku [5]. Onemocnění se projevuje napadením chlupových váčků, mazových a potních žláz a narušením pokožky uší, čenichu a membrány křídel [5,6]. Stejné příznaky byly nalezeny u našich netopýrů, ale na rozdíl od situace v Severní Americe není v Evropě onemocnění doprovázeno pandemií [7].
Práce bude částečně navazovat na diplomovou práci (DP) „Evoluční ekologie rodu Geosmithia“, ve které byla zjištěna enzymatická kapacita hub rodu Geosmithia (houby asociované s podkorním hmyzem) a ve které byla vyvinuta metodika pro určení velikosti genomu hub metodou průtokové cytometrie. Součástí práce bude také doplnění a publikace výsledků z DP. Konečným bodem práce bude porovnání dat z rodu Geosmithia a ophiostomatálních hub, případně rodu Geomyces, což umožní naleznout obecné mechanismy, které se uplatnily v evoluci těchto skupin hub.Dílčí cíle se budou věnovat studiu vzniku ambrosiových druhů hub z jejich blílzkých příbuzných žijích v symbioze s lýkožravým hmyzem. V průběhu DP bylo zjištěno že ambrosiové druhy geosmithií mají několikanásobně větší genom než druhy ostatní. Skokové zvětšení genomu umožňuje jednak navýšení velikosti buněk (a tím úživnosti buněk), tak zvýšení produkce allelopatických látek, které tyto houby produkují.
Hlavní hypotézy:
1. Je možné studovat adaptace typické pro jednotlivé ekologické skupiny in vitro - porovnáním enzymatických aktivit, biochemického složení buněk a spektra a aktivity sekundárních metabolitů mezi ekologicky odlišnými a zároveň geneticky příbuznými druhy. Studované houby žijí v úzce vazbě na své prostředí, proto je otázkou, jestli in vitro experimetny mohou vysledvat případné adaptace či jejich trendy. Další otázkou je, zda se hledané adaptace nalézají na úrovni fyziologikých a biochemických vlastností.
2. Existují obecněji platné trendy (platné u ophiostomatálních hub, rodu Geosmithia a Geomyces) v adaptacích studovaných hub? DP práce nepříklad ukázala že specialisté (včetně patogenního druhu) se od generalistů liší úžším spektrem utilizovaných zdrojů živina a potřebou esenciálních látek. Jednotlivé ekologické skupiny se dále liší ve schopnosti rozkládat ligno-celulózu. Podobný trend, známý u vyšších organismů (pravidlo „jack of all trades, master of none“), nebyl u hub dříve studován.
Dílčí hyoptézy
1. . Enzymatické schopnosti, antibiotické aktivity a biochemické složení (mastné kyseliny) hub žijících v symbioze z podkorním hmyzem jsou ovlivněny koevolucí s podkorním hmyzem.
2. Evoluce morfologie velko-sporých ambrosiových hub probíhá konvergentně prostřednictvím zvětšování genomu. Ambrosiové houby jsou schopny udržet svou dominanci prostřednictvím produkce antibiotických a alelopatických látek
3. Patogenní druhy rodu Geomyces jsou po stránce enzymatických aktivit a produkce sekundárních metabolitů odlišné od saprotrofních druhů téhož rodu. Předpokládáme zúžení spektra utilizovaných látek, oproti druhům půdním.
Cíle a metodika:
1. Charakterizovat enzymatické schopnosti hub rodu Ophiostoma s ohledem k jejich ekologii.
Ke zjišťování enzymatické kapacity jednotlivých druhů bude použita metoda BIOLOG MicroPlate™. Destičky umožňují testovat schopnost růstu houby na daném typu substátu (každá destička obsahuje 95 odlišných substrátů a 1 negativní kontrolu). Budou použity destičky Phenotype MicroArrays™: PM3B (zdroje dusíku), PM4A (fosfor a síra), PM5 (nutriční doplňky) a destička FF (uhlík). Dále budou zjišťovány aktivity extracelulárních enzymů uvedených v tabulce (viz níže). K analýze enzymů budou použity sbírkové kmeny ophiostomatálních hub, u kterých je známa šíře jejich niky (rostlinní generalisti vs. specialisti) a síla vazby na kůrovce (fakultativní vs. obligátní symbionti). Cílem bude zjistit, zda enzymatické schopnosti ophiostomatálních hubjsou dány jejich ekologií a podléhají tedy konvergentní evoluci. Výsledky z této části disetační práce bude možno srovnat s výsledky zmíněné DP. Dále bude u ophiostomatálních hubagarovými testy zjišťována schopnost degradace sekundárních metabolitů nacházejících se v pletivech konifer.
2. Stanovit kvalitu a kvantytu mastných kyselin u ophiostomatálních hub
Spektrum a kvantita mastných kyselin bude studována metodou plynové chromatografie (GC-MS) podle metodiky vyvinuté Šnajdr et al. [8]
3. Porovnat antibiotické a alelopatické vlastnosti ophiostomatálních hub s ohledem na jejich ekologii
Budou extrahovány sekundární metabolity Ophiostoma spp. a budou zjišťovány jejich antibiotické a alelopatické vlastnosti proti entomopatogennům (Beauveria bassiana), dřevním saprofytům (Penicillium decumbens), dřevním endofytům (Graphium fimbriisporum), S. cerrevisiae a G+ a G- bakteriím.
4. Zjistit velikost genomu u ambrosiových hub a porovnat ji s blízce příbuznými druhy hub.
Velikost genomu bude zjišťována metodou průtokové cytometrie optimalizované během (DP). Absolutní velikost genomu bude vypočtena podle standardu vyvinutého během DP. Velikost genomu ambrosiových hub bude dále porovnána s velikostí genomu blízce příbuzných druhů hub.
5. Testovat nové fluorochromy pro zjištění velikosti genomu průtokovou cytometrií (FCM)
Pro zjišťování velikosti genomu metodou FCM je zapotřebí použít fluorochrom, který se váže k dsDNA bez bázové preference. Tradičně se používá propidium iodide (PI), u kterého je známa jeho frekvence vazby na DNA. V nynější době je k dispozici široké spektrum teoreticky vhodných fluorochromů. V disertační práci bude zjišťována vhodnost barviv SYTOX® Green, 7-AAD a TO-PRO®-3 Iodide.
6. Zjišťovat toleranci k vysychání u Ophiostoma spp. a Geosmithia spp.
Podle doposud provedených studií se zdá, že na rozdíl od ophiostomatálních hub,Geosmithia spp. dominují v požercích vytvářených ve větvích s menším průměrem. Takový habitat se vyznačuje nižší vlhkostí a větším kolísáním teplot [9]. Je tedy možné, že nika ophiostomatálních hub a Geosmithia spp. je dána odlišnou tolerancí k vysychání. Z toho důvodu bude testována viabilita spor na sporách vystavených suchu po různé časové intervaly. Procentuální viabilita bude určena metodou FCM.
7. Zjistit diverzitu a taxonomii Geomyces spp. z jeskynního prostředí
V souběžném projektu budou z jeskynních prostorů izolovány Geomyces spp. Diverzita a taxonomie rodu bude dále zjišťována molekulárními metodami. Cílem bude rozlišit v půdních izolátech druhy pro porovnání s druhem G. destructans a zjistit jejich taxonomickou pozici.
8. Stanovit aktivity enzymů důležitých pro patogenezi
U Geomyces spp. izolovaných z jeskyní budou sledovány aktivity enzymů, které jsou schopny rozložit kolagen, elastin, keratrin a močovinu. Dále bude zjišťována heamolytická aktivita a přitomnost sideroforů (příjem železa z krve).
9. Extrahovat sekundární metabolity Geomyces spp.
U izolovaných Geomyces spp. budou extrahovány sekundární metabolity, u kterých bude dále sledována jejich biologická aktivita proti kožním buňkám netopýrů (kožní fibroblasty).
Shrnutí
Cílem disertační práce bude zjištění adaptivních znaků, které se podílely v evoluci hub při přechodu k symbiotickému či patogennímu způsobu života. Modelovými organismy budou druhy ophiostomatálních hub rodu Geosmithiaa Geomyces. Obě skupiny hub zahrnují vysoce patogenní druhy (O. novo-ulmi, Geosmithia morbida, Geomyces destructans), ophiostomatálních hub pak i druhy s různě silnou asociací s kůrovci vedoucí až k obligátní symbiose s ambrosiovými brouky. Významným bodem specializace (obligátní symbiosa, patogen) je schopnost efektivně zpřístupňovat živiny z daného substrátu. Z toho důvodu bude srovnávána enzymatická výbava a produkce sekundárních metabolitů specialistů a generalistů v rámci jednotlivých rodů. Předpokládáme nalezení obecnějších trendů platících mezi všemi studovanými skupinami.
Dále se disertační práce bude zabývat evolucí velko-sporých ambrosiových hub. Bude zjišťováno, zda bylo zvětšení spor doprovázeno zvětšením genomu. Velikost genomu bude měřena průtokovou cytometrií za použití metodiky vyvinuté v rámci DP. Přínosem disertační práce bude i testování nových fluorochromů při zjišťování velikosti genomu průtokovou cytometrií.
Vyjádření školitele na krytí finančních nákladů
Práce bude hrazena z projektů „Adaptace netopýrů na plísňové onemocnění geomykózou“ GAČR P506/12/1064 (2012-2015) a IMPULS (OPVK30) CZ.1.07/2.3.00/30.0003, „Inovace v Mikrobiologii - Postdoktorandské výukové a laboratorní Středisko“ (2012-2015).


V Praze dne:

Podpis řešitele

Podpis školitele

Reference:
1. Jones, K.G. and M. Blackwell, Phylogenetic analysis of ambrosial species in the genus Raffaelea based on 18S rDNA sequences. Mycological Research, 1998.102(6): p. 661-665.
2. Batra, L.R., Ambrosia fungi: a taxonomic revision, and nutritional studies of some species. Mycologia, 1967.59(6): p. 976-1017.
3. Gregory, T.R., Coincidence, coevolution, or causation? DNA content, cellsize, and the C-value enigma. Biological Reviews, 2001.76(1): p. 65-101.
4. Chaturvedi, V. and S. Chaturvedi, Editorial: What is in a Name? A Proposal to Use Geomycosis Instead of White Nose Syndrome (WNS) to Describe Bat Infection Caused by Geomyces Destructans. Mycopathologia, 2011.171(4): p. 231-233.
5. Blehert, D.S., et al., Bat White-Nose Syndrome: An Emerging Fungal Pathogen? Science, 2009.323(5911): p. 227.
6. Meteyer, C.U., et al., Histopathologic Criteria to Confirm White-nose Syndrome in Bats. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 2009.21(4): p. 411-414.
7. Martínková, N., et al., Increasing incidence of Geomyces destructans fungus in bats from the Czech Republic and Slovakia. PLoS One, 2010.5(11): p. e13853.
8. Šnajdr, J., et al., Activity and spatial distribution of lignocellulose-degrading enzymes during forest soil colonization by saprotrophic basidiomycetes. Enzyme and Microbial Technology, 2008.43(2): p. 186-192.
9. Kolařík, M. and R. Jankowiak, Specificity of Geosmithia fungi on bark beetles living on the family Pinaceae - new evidence of long-term co-evolution. FEMS Microbiology Ecology.