Studium environmentálních vzorků pomocí pyrosekvenování a vliv intragenomové variability ITS rDNA oblasti na odhady diverzity hub

• Thesis title in Czech: Studium environmentálních vzorků pomocí pyrosekvenování a vliv intragenomové variability ITS rDNA oblasti na odhady diverzity hub
• Thesis title in English: Pyrosequencing analysis of fungal assemblages and the effect of ITS rDNA intragenomic variation on diversity estimates
• Key words: pyrosekvenování, 454 sekvenování, ITS oblast, vnitřní přepisovaný mezerník, intragenomová variabilita, intradruhová variabilita, pseudogeny, houby, diverzita hub
• English key words: pyrosequencing, 454 sequencing, ITS region, internal transcribed spacer, intragenomic variation, intraspecific variation, pseudogenes, fungi, fungal diversity
• Academic year of topic announcement: 2012/2013
• Thesis type: Bachelor's thesis
• Thesis language: čeština
• Department: Department of Botany (31-120)
• Supervisor: Mgr. Miroslav Kolařík, Ph.D.
• Author: hidden - assigned by the advisor
• Date of registration: 08.11.2012
• Date of assignment: 08.11.2012
• Date of electronic submission: 17.05.2013
• Date of proceeded defence: 11.06.2013
• Opponents: Mgr. Tomáš Větrovský, Ph.D.
• Advisors: Mgr. Martin Kostovčík

Preliminary scope of work

Úvod:
Jaderná ribosomální DNA (nrDNA) a zejména její ITS oblast je klíčovým a nejrozšířenějším markerem používaným při determinaci a studiu příbuznosti druhů hub. ITS oblast nrDNA je taktéž nejčastěji používaným genem pro stanovení diverzity společenstev. nrDNA se v genomu nachází ve formě mnohonásobných tandemových repetic, které můžou dosahovat až stovek kopií. Běžně používané přímé sekvenování nicméně produkuje sekvence, které jsou konsenzem všech kopií v genomu. Evoluce v koncertu (concerted evolution) a mechanizmy, které ji zprostředkují (např. genová konverze pomocí homologní rekombinace), mají za následek poměrně rychlou a účinnou homogenizaci jednotlivých kopií. Přesto část variability zůstává zachována, včetně uchování nefunkčních kopií (pseudogenů). Míra vnitrogenomové variability byla dosud studována jen u několika zástupců z říše hub a informace napříč širším spektrem druhů z různých skupin chybí. Tento fakt může představovat významné riziko při stanovení reálné četnosti druhů ve společenstvech studovaných pomocí moderních 454 pyrosekvenačních technologií.
Cíle řešení projektu: Rešerše shrnující dosavadní studie diverzity hub využívající 454 sekvenování, shrnutí metodiky použité při 454 sekvenování a shrnující znalosti o vnitrogenomové variabilitě ITS rDNA hub.
Body rešerše.
1) Mykologické práce využívající 454 sekvenování. Vhodné je vytvoření tabulky s údaji o citaci/studované skupině hub/použitých primerů/ve zkratce metodika přípravy DNA, PCR, vyhodnocení/zjištěné diverzitě hub.
2) Dosavadní poznatky o vnitrogenomovém polymorfizmu ITS rDNA u hub – množství repetic, variabilita, možné funkční důsledky.
3) Rozišení pseudogenů u hub.
4) Princip 454 sekvenační analýzy – rozbor metod od izolace DNA, PCR a přípravy vzorků na sekvenování až po statistické zpracování.

Nastínění navazujicí DP.
Anotace:
Jaderná ribosomální DNA (nrDNA) a zejména její ITS oblast je klíčovým a nejrozšířenějším markerem používaným při determinaci a studiu příbuznosti druhů hub. ITS oblast nrDNA je taktéž nejčastěji používaným genem pro stanovení diverzity společenstev. nrDNA se v genomu nachází ve formě mnohonásobných tandemových repetic, které můžou dosahovat až stovek kopií. Běžně používané přímé sekvenování nicméně produkuje sekvence, které jsou konsenzem všech kopií v genomu. Evoluce v koncertu (concerted evolution) a mechanizmy, které ji zprostředkují (např. genová konverze pomocí homologní rekombinace), mají za následek poměrně rychlou a účinnou homogenizaci jednotlivých kopií. Přesto část variability zůstává zachována, včetně uchování nefunkčních kopií (pseudogenů). Míra vnitrogenomové variability byla dosud studována jen u několika zástupců z říše hub a informace napříč širším spektrem druhů z různých skupin chybí. Tento fakt může představovat významné riziko při stanovení reálné četnosti druhů ve společenstvech studovaných pomocí moderních 454 pyrosekvenačních technologií. Cílem projektu by tedy mělo být odhalení vnitrogenomové variability ITS oblasti mezi zástupci širokého spektra druhů hub pomocí pyrosekvenačních technologií, zpřesnění stanovení reálné biodiverzity uvnitř houbových společenstev a potvrzení hypotéz o významu četnosti kopií nrDNA pro adaptabilitu a evoluci druhů žijících v rychle se měnícím prostředí. Dalším cílem je typizace kmenů ze sbírky CCF přímým sekvenováním ITS oblasti.
Cílem práce je stanovení vnitrogenomové variability v ITS oblasti rDNA napříč vývojovými liniemi hub a ekologickými skupinami. K tomuto účelu bude sloužit využití masivně paralelního sekvenování, konkrétně 454 pyrosekvenování, které je schopné tento kritický mezioborový problém odkrýt při relativně nízkých nákladech. Poznání této variability bude mít přímý dopad na odhady diverzity hub získaných ze studia environmentálních vzorků pomocí pyrosekvenování. Dalším cílem bude hledání vztahu mezi vnitrogenomovou variabilitou ITS oblasti a s ní související tendenci k mutačním změnám a úlohou v evoluci u různých zástupců hub s širokou škálou ekologií. Tento projekt umožní unikátní široce koncipovanou studii poodkrývající roušku tajemství zahalujícího významnou část genomu u hub a jedinečné propojení pracovišť věnujících se taxonomii resp. využívajících houby jako výzkumné objekty spolu s mykologickými sbírkami, které budou poskytovateli houbových kmenů. Tím dojde i k neméně důležité revalidaci taxonomického zařazení použitých sbírkových kmenů na základě molekulárních dat.
Způsob řešení:
Výběr kmenů: Předpokládaný počet analyzovaných kmenů podle předběžného průzkumu bude čítat 300 houbových druhů napříč všemi významnými liniemi běžně kultivovaných hub. Z ostatních linií budou začleněny pouze Neocallimastigomycota (ÚŽFG AV ČR). Výběr kmenů bude zacílen na půdní a endofytní houby, jakožto obyvatele nejčastěji studovaných hyperdiverzních substrátů. Do studie budou zařazeny kmeny ze sbírky hub na katedře botaniky PřF UK (Culture Collection of Fungi), kmeny získané v rámci projektů probíhajících na katedře botaniky (izoláty z půdy a opadu, endofyti rostlin), kmeny ze sbírek na MBÚ AV ČR jako je sbírka bazidiomycetů (http://www.biomed.cas.cz/ccbas/fungi.htm) a sbírky Laboratoře genetiky a metabolizmu hub, Laboratoře biologie hub a Laboratoř environmentální mikrobiologie. Kmeny mykorhizních hub budou získány z laboratoře mykorrhizních symbióz Botanického Ústavu AV ČR a ze sbírky Ústavu ochrany lesa a myslivosti na Lesnické a dřevařské fakultě Mendelovy Univerzity v Brně. Od vybraných druhů hub bude analyzováno více kmenů (podle dostupnosti) z různých geografických lokalit.Nutným předpokladem pro začlenění do analýzy bude čistota kultury. Ta bude zaručena kultivací na příslušném médiu a monosporickou izolací. Izolace DNA bude provedena pomocí kitu ArchivePure DNA Yeast and Gram -+ Kit (5Prime), případně s drobnými modifikacemi podle potřeb konkrétního druhu. Pro získání konsensuální sekvence ITS oblasti sloužící ke kontrolní typizaci poskytnutých kmenů bude provedeno přímé sekvenování na sekvenátoru Laboratoře sekvenace DNA biologické sekce PřF UK a u firmy Macrogen. Primární amplifikace ITS oblasti rDNA bude provedena pomocí standardně používaných universálních houbových primerů (White et al. 1990), případně jejich modifikovaných variant (Borneman& Hartin 2000). Na odlišení sekvencí z různých druhů při samotné analýze dat z pyrosekvenace bude sloužit značení primárních amplikonů pomocí naligovaných MID adapterů. Tento postup je přesnější oproti používanému postupu se sekundární PCR pomocí tzv. tagovaných primerů. Počet dostupných MID adapterů je limitován. Proto bude celková kolekce hub rozdělena do skupin označených stejným MID adapterem, v rámci kterých budou sekvence spolehlivě rozeznatelné samotnou sekvencí ITS. Tato varianta je i podstatně ekonomičtější. Na veškeré PCR amplifikace bude použita „proofreading a high-fidelity“ polymeráza zamezující vnášení polymorfizmů a vzniku chimér v průběhu amplifikační reakce (Lahr& Katz 2009). Následně bude provedena emulsní PCR a samotná pyrosekvenace podle instrukcí výrobce a za použití originálních kitů kompatibilních s přístrojem GS Roche Junior. Data z pyrosekvenace budou podrobena standardní proceduře zpracování (Baldrian et al. 2011). To bude zahrnovat pročištění datasetu od sekvencí nesplňujících délkový limit, nekorespondujících s povolenou odchylkou jednonukleotidové záměny s použitým amplifikačním primerem případně neobsahující MID adapter. Také bude dataset podroben analýze na výskyt chimér a jejich následnému odstranění. Pro statisticky pravděpodobný záchyt všech ITS kopií (rozptyl od 40-200 repetic na genom) analyzovaných kmenů (odhadovaný počet 300 druhů po 10 kmenech) bude potřeba získat 400-500 tisíc sekvencí, které zaručí pokrytí veškeré variability. To odpovídá přibližně pěti běhům na přístroji GS Roche junior. Konečný počet se bude odvíjet od konkrétního počtu kvalitních sekvencí získaných z jednotlivých analýz. Finální dataset bude zpětně rozdělen podle MID adapteru do skupin, které by hypoteticky měly obsahovat sekvence druhů do ní původně začleněné. Následně se pomocí homologního vyhledávání algoritmem Blast na základě konsenzuální sekvence získané přímým sekvenováním roztřídí sekvence náležící k jednomu druhu. Pak dojde k samotnému mapování částečných polymorfizmů (pSNP) (James et al. 2009) na konsensuální sekvenci daného druhu. V potaz budou brány jen pSNP vyskytující se ve více než jedné kopii. Klastrování bude provedeno v programu CD-HIT a PlutoF. Sekvence výrazně odlišné od konsensu pro daný druh (délkou a procentem variability) budou podrobeny postupu dle Feliner a Rosselló (2007), který umožnuje odhalení případného pseudogenu (např. na základě stability sekundární struktury ITS2). Ze získaných dat bude odvozena a dále diskutována propojenost mezi ekologií daného druhu a pozorované vnitrogenomové variabilitě a s ní nepřímo souvisejícím počtem kopií rDNA.

Preliminary scope of work in English

Nuclear ribosomal DNA (nrDNA) and specifically ITS region is a crucial marker used for fungal determination and studies of relationship between fungal species. This region is also the most widely used gene for assessment of diversity in fungal communities. nrDNA is organized in tandem arrays which may contain hundreds of copies. Commonly used direct sequencing may result in consensus sequence of all present copies. Concerted evolution and gene conversion mediated by homologous recombination often cause fast and effective homogenization of divergent copies but some variability remains including non-functional pseudogenes. Extent of intragenomic variability was studied so far in a few fungal species and information of greater phylogenetic extent is missing. This fact poses a significant risk in assessment of fungal diversity in communities studied by means of modern 454 pyrosequencing. The BC thesis should review the recent prgress in using 454 sequencing in mycology and review knowledge about intragenomic variability of ITS rDNA in fungi.