V poslední době se věnuje stále větší pozornost chemopreventivním sloučeninám a to zejména fytochemikáliím, které jsou všeobecně považovány za zdraví prospěšné látky a to hlavně díky jejich přírodnímu původu. Velkou skupinu fytochemikálií představují flavonoidy, které jsou obsaženy v mnoha potravních doplňcích. Spotřeba těchto koncentrovaných zdrojů flavonoidů se v posledních letech dramaticky zvýšila. Užívání flavonoidních látek ve velkém množství však může být spojeno s některými nežádoucími účinky. Některé flavonoidy jsou známé modulátory enzymů I. a II. fáze biotransformace xenobiotik a jejich indukce může vést ke zvýšení aktivace karcinogenů.V rámci této diplomové práce byly zkoumány účinky vybraných flavonoidních sloučenin α-naftoflavonu, β-naftoflavonu, myricetinu a dihydromyricetinu a karcinogenů (BaP, PhIP) na enzymy II. fáze biotransformace, sulfotransferasy (SULT). Pro stanovení indukčního efektu byly připraveny protilátky pro jejich imunodetekci. Peptidické imunogeny, které byly vybrány z proteinových sekvencí potkaních sulfotransferas rSULT1A1, 1B1, 1C1, 1C2, 1C1/2, 1E1 a 2A1 byly použity ve formě KLH konjugátů pro imunizaci slepic za účelem získání antipeptidových protilátek (IgY) z vaječných žloutků. Frakce jednotlivých IgY byly izolovány jednoduchou extrakcí a následným vysrážením pomocí chloridu sodného. Výtěžek IgY činil asi 150 mg/žloutek (6,8 mg/ml žloutku). Mezi nejhojnější enzymy patří SULT1A1, proto byla protilátková frakce proti tomuto proteinu dále purifikována pomocí afinitní chromatografie, čímž byly získány pouze specifické protilátky. Účinek flavonoidních látek a karcinogenů na indukci SULT na úrovni proteinu však nebylo možné detekovat pomocí metody „Western blot“, a to ani s afinitně purifikovanou protilátkou SULT1A1.Následně byla v cytosolárních vzorcích z premedikovaných zvířat zkoumána aktivita SULT. V rámci této práce byly testovány dvě metody stanovení enzymové aktivity sulfotransferas. S ohledem na to, že v cytosolárních vzorcích z tkáně potkanů je obvykle přítomno více isoenzymů SULT, byla optimalizována metoda stanovení aktivity SULT na základě detekce sulfatovaného p-nitrofenolu pomocí HPLC. Aktivity sulfotransferas v potkaních jaterních cytosolech premedikovaných zvířat, s výjimkou PhIP, se výrazně nezměnily. Aktivity sulfotransferas v cytosolech získaných z tlustého střeva premedikovaných potkanů byly až 100x nižší v porovnání s jaterní tkání a nevykázaly výrazné změny v závislosti na premedikaci.
Preliminary scope of work in English
Currently, an increasing attention is being paid to phytochemicals as one of the most widely used chemopreventive compounds, generally considered as health-promoting and safe. Flavonoids representing a large group of phytochemicals are present in many dietary supplements formulated from natural sources. The consumption of these concentrated phytochemicals has dramatically increased in the recent decade. It appears, however, that the ingestion of flavonoids might be associated with some adverse effects. Some flavonoids are known modulators of enzymes involved in phase I and phase II metabolism of xenobiotics biotransformation, thus their induction may result in an increase of carcinogen activation.In this study, the effects of selected flavonoid compounds α-naphthoflavone, β-naphthoflavone, myricetin, and dihydromyricetin, and carcinogens (BaP, PhIP) on phase II metabolism enzymes, sulfotransferases (SULT), have been investigated. To determine the induction of SULT, antibodies for their immunodetection have been developed. Peptide antigens derived from sequences of selected rat sulfotransferases rSULT1A1, 1B1, 1C1, 1C2, 1C1/2, 1E1, and 2A1, were used as KLH conjugates for hen immunization to obtain yolk anti-peptide antibody (IgY). Fractions of IgY were isolated from eggs yolks by simple extraction and precipitation procedure with sodium chloride. The yield of IgY was about 150 mg per yolk (6.8 mg/ml of yolk). Since SULT1A1 is the most abundant SULT, the anti-peptide SULT1A1 IgY has been further purified by affinity chromatography in order to obtain only specific antibodies. However, even with affinity purified antibody, the effect of flavonoid compounds and carcinogens on SULT induction at the protein level was not possible to fully determine by immunodetection.The activity of SULT in cytosol samples of animals treated with flavonoids or carcinogens has been studied as well. In this study, two assays of SULT enzymatic activity were tested. Being aware that the tissue cytosol samples are usually a complex mixture of different isoenzymes of SULT, we optimized the determination of the activity based on p-nitrophenyl sulfate detection on HPLC. SULT activities in rat liver cytosols, with the exception of PhIP administration, did not show marked changes in response to animal treatment, when compared with the SULT activity of un-treated animals. The SULT activities in colon cytosols were approximately 100x lower in comparison to liver cytosols and did not significantly change after animal treatment.
- assigned by the advisor