1. Chappidi N, Nascakova Z, Boleslavska B, Zellweger R, Isik E, Andrs M, Menon S, Dobrovolna J, Balbo Pogliano C, Matos J, Porro A, Lopes M, Janscak P.: Fork Cleavage-Religation Cycle and Active Transcription Mediate Replication Restart after Fork Stalling at Co-transcriptional R-Loops. Mol Cell 2020, 77(3):528-54 2. Bauer M, Nascakova Z, Mihai AI, Cheng PF, Levesque MP, Lampart S, Hurwitz R, Pfannkuch L, Dobrovolna J, Jacobs M, Bartfeld S, Dohlman A, Shen X, Gall AA, Salama NR, Töpfer A, Weber A, Meyer TF, Janscak P, Müller A. The ALPK1/TIFA/NF-κB axis links a bacterial carcinogen to R-loop-induced replication stress. Nat Commun. 2020 Oct 9;11(1):5117
Předběžná náplň práce
Replikace DNA jeden z nejdůležitějších a nejsložitějších procesů v buňce, jenž zajišťuje přesné a včasné zdvojení celého genomu. Nejen exogenní poškození DNA, ale také vnitřní struktury DNA včetně G-kvadruplexů (G4) a R-smyček, představují hlavní překážky replikace DNA a mají potenciál ohrozit integritu genomu. Není překvapením, že protinádorové terapie se zaměřují na takového struktury a procesy, a to navzdory skutečnosti, že o základních molekulárních mechanismech je známo jen málo. Je zřejmé, že zajištění postupu replikační vidlice vyžaduje nad rámec replisomu součinnost dalších sofistikovaných proteinových komplexů. Prozatím není zcela jasné, jaký je vztah mezi tvorbou G4-kvadruplexů a R-smyčkami, jaké proteiny se podílejí na jejich homeostáze a jaké faktory diverzifikují jejich fyziolocké a patologické role. Cílem našeho výzkumu je identifikovat proteiny asociované se strukturami G4 a R-smyček a porozumět jejich roli při tvorbě a rozlišení G4/R-smyček, jakož i vztahu k progresi replikační vidlice a související opravě DNA. PhD student se bude podílet na přípravě nástrojů pro studium struktur G4 (příprava různých buněčných linií) a na identifikaci proteinů podílejících se na metabolismu těchto struktur proteomickými přístupy následovanými analýzou pomocí hmotnostní spektrometrie (např. proximitního značení proteinu biotinem pomocí APEX metody, afinitní chromatinové precipitace) a funkčním screenem siRNA knihovny. Proteiny identifikované v těchto screenech budou vybrány pro další validaci a charakterizaci na základě jejich relevance k metabolismu G4/R-smyček a replikační vidlice a role při udržování integrity genomu.
Předběžná náplň práce v anglickém jazyce
DNA replication is an essential and one of the most complex processes in the cell that ensures faithful, complete and timely duplication of genome. Not only exogenous DNA damage but also intrinsic DNA structures including G-quadruplexes (G4) and R-loops, their stabilization or unscheduled formation represent major replication obstacles with possible detrimental effects on genome integrity. Not surprisingly, those processes are pharmacologically targeted in anticancer therapy, despite the fact that only little is known about the underlying molecular mechanisms. It becomes apparent that maintenance of processive DNA replication requires sophisticated protein networks beyond the core replisome. Whether there is a direct crosstalk between G4 and R-loops, what proteins are involved in their homeostasis and what are the factors diversifying between their beneficial and pathological roles is not well understood. The goals of our research are to identify proteins associated with G4 and R-loop structures and understand their roles in G4/R-loop formation and resolution as well as relationship to replication fork progression and associated repair. PhD student will be involved in preparation of tools for study of G4 structures (establishment of various cell lines) and in identification of proteins involved in metabolism of these structures by mass spectrometry-based proteomics approaches, including APEX-based proximity labeling and chromatin affinity precipitation methods, and by functional siRNA screen. Proteins identified in these screens will be selected for further validation and characterization based on their relevance to G4/R-loop and replication fork metabolism, and role in maintenance of genome integrity.
