Vrozená imunita a cirkulující monocyty - význam a funkce v patogenezi celiakie.

• Název práce v češtině: Vrozená imunita a cirkulující monocyty - význam a funkce v patogenezi celiakie.
• Název v anglickém jazyce: The innate immunity and circulating monocytes - their significance and function in pathogenesis of coeliac disease.
• Klíčová slova: celiakie, monocyty, prolaktin, Toll-like receptory, cytokiny
• Klíčová slova anglicky: celiac disease, monocytes, prolactin, Toll-like receptors, cytokines
• Akademický rok vypsání: 2010/2011
• Typ práce: diplomová práce
• Jazyk práce: čeština
• Ústav: Katedra antropologie a genetiky člověka (31-110)
• Vedoucí / školitel: RNDr. Pavlína Daňková, Ph.D.
• Řešitel: skrytý - zadáno vedoucím/školitelem
• Datum přihlášení: 23.11.2010
• Datum zadání: 23.11.2010
• Datum odevzdání elektronické podoby: 27.08.2012
• Datum proběhlé obhajoby: 11.09.2012
• Oponenti: RNDr. Lenka Palová Jelínková, Ph.D.

Předběžná náplň práce

Prolaktin je hypofyzární hormon, jenž podporuje růst a diferenciaci mléčné žlázy, laktaci a také reprodukční děje. Avšak tzv. mimohypofyzární prolaktin produkovaný zejména buňkami imunitního systému (T-lymfocyty a monocyty) vystupuje jako cytokin, který moduluje imunitní reakce. Monocyty kromě sekrece prolaktinu exprimují na svém povrchu rozmanité receptory, např. Toll-like receptory, které se podílejí na vrozené imunitní odpovědi, konkrétně TLR2 a TLR4 jsou klíčové pro rozpoznání bakteriálních komponent a TLR7 je schopen rozpoznávat ssRNA virů. Po navázání ligandu na tyto TLRs dochází k expresi prozánětlivých cytokinů (TNF-α, IL-6 a IL-12), produkci některých z nich (TNF-α a IL-12) stimuluje také prolaktin (PRL). Podporuje vývoj antigen prezentujících buněk nesoucích HLA II. třídy, reguluje maturaci nezralých thymocytů na zralé CD4+ a CD8+ T‑lymfocyty, podporuje produkci imunoglobulinů a celé řady autoprotilátek - např. tkáňové transglutaminázy u celiakie. Celiakie je orgánově specifické autoimunitní onemocnění, které vzniká v důsledku přecitlivělosti na obilný lepek u geneticky vnímavých jedinců. Touto genetickou predispozicí jsou geny lokalizované na krátkém raménku šestého chromozomu - geny HLA-DQ2 a HLA-DQ8, v jejichž blízkosti se nachází také gen pro prolaktin. Naším cílem je objasnění role vrozené imunity a cirkulujících monocytů pomocí detekce změny exprese vybraných Toll-like receptorů (TLR2, TLR4, TLR7), prolaktinu a některých prozánětlivých cytokinů (TNF-α, IL-6, IL-12) a protizánětlivého cytokinu IL-10.

Metody: Pro stanovení hladin mRNA studovaných genů bude z monocytů získaných imunomagnetickou separací izolována RNA za použití RNeasy Mini kitu; kvantitativní RNA testování bude provedeno metodou QPCR.
Při DNA genotypizaci bude stanovení funkčního SNP v regulační oblasti PRL genu provedena pomocí PCR-RFLP analýzy za použití originálně navržených oligonukleotidů.
Součástí metod bude zavádění metody in vitro kultivace a stimulace monocytů periferní krve.

Očekávané výstupy: Součástí pracovní hypotézy je, že imunitní dysbalance vede ke zvýšení exprese TLR receptorů, PRL, pro-zánětlivých cytokinů a snížení exprese protizánětlivých cytokinů v monocytech periferní krve. Očekává se, že zvýšená produkce PRL v monocytech u pacientů s celiakií je následkem funkčního polymorfismu v PRL genu.

Cíle: Rozpoznat úlohu periferního prolaktinu v nastolení imunitní dysbalance, která vede k celiakii. Získané poznatky přispějí k rozšíření současných znalostí a mohou také přispět k zavedení účinnější predikce i léčby celiakie.
Cíle: Rozpoznat úlohu periferního prolaktinu v nastolení imunitní dysbalance, která vede k celiakii. Získané poznatky přispějí k rozšíření současných znalostí a mohou také přispět k zavedení účinnější predikce i léčby celiakie.

Předběžná náplň práce v anglickém jazyce

Prolactin is a pituitary hormone that promotes growth and differentiation of mammary glands, lactation and reproductive processes. However, the so-called extra-pituitary prolactin produced mainly by immune cells (T-lymphocytes and monocytes) acts as a cytokine that modulates immune response. Monocytes express very diverse membrane receptors including Toll-like receptors (TLRs), that are involved in the innate immune response, specifically TLR2 and TLR4 are crucial for recognition of bacterial components and TLR7 recognizes virus’s ssRNA. After ligand binding to TLRs monocytes express pro-inflammatory cytokines (TNF-α, IL-6 and IL-12), secretion some of them stimules PRL (TNF-α and IL-12), too. PRL supports the development of antigen-presenting cells carrying HLA class II molecules, regulates the maturation of immature thymocytes into mature CD4 + and CD8 + T cells, stimulates the production of immunoglobulins and a variety of auto antibodies such as tissue transglutaminase in coeliac disease. Coeliac disease is organ-specific autoimmune disease that arises as a consequence of hypersensitivity to the grain gluten in genetically susceptible individuals. For part of genetic predisposition are resposible genes located on the short arm of chromosome 6, HLA-DQ2 and HLA-DQ8; at the close vicinity is localized also prolactin gene. Our aim is clarify the role of innate immunity and circulating monocytes in pathogenesis of celiac disease, we focuse on changes in expression of selected Toll-like receptors (TLR2, TLR4, TLR7), prolactin, some pro- a anti-inflammatory cytokines (TNF-α, IL-6, IL-12, IL-10).

Methods:To determine mRNA levels of studied genes, monocytes isolated by immunomagnetic separation will serve as a source of RNA that will be extracted by using RNeasy Mini kit; quantitative RNA testing will be performed by QPCR.
The DNA genotyping and determination of functional SNPs in regulatory regions of PRL gene will use PCR-RFLP technique employing originally designed oligonucleotides. Part of our work will be the implementation of the method in vitro cultivation and stimulation peripheral blood monocytes.

Outcome:The working hypothesis is that immune imbalance leads to increased expression of TLRs, PRL and pro-inflammatory cytokines and reduction of anti-inflammatory cytokines receptors in peripheral blood monocytes and stimulates the production of PRL in these cells during inflammation. It is expected that the increased PRL production in monocytes in patients with coeliac disease is the result of a functional polymorphism in the PRL gene.

Objectives: To recognize the role of peripheral prolactin in the establishment of immune dysbalance that leads to celiac disease. Obtained knowledge will contribute to the expansion of existing knowledge and can also help to a more efficient prediction and treatment of coeliac disease.

Objectives: To recognize the role of peripheral prolactin in the establishment of immune dysbalance that leads to celiac disease. Obtained knowledge will contribute to the expansion of existing knowledge and can also help to a more efficient prediction and treatment of coeliac disease.