Témata prací (Výběr práce)Témata prací (Výběr práce)(verze: 384)
Detail práce
   Přihlásit přes CAS
Struktura a funkce rekombinantního P2X4 receptoru
Název práce v češtině: Struktura a funkce rekombinantního P2X4 receptoru
Název v anglickém jazyce: Structure and function of recombinant P2X4 receptor
Klíčová slova: P2X receptor, disulfidické můstky, extracelulární vestibul, bodová mutageneze
Klíčová slova anglicky: P2X receptor, disulphide bonds, extracellular vestibule, single point mutagenesis
Akademický rok vypsání: 2009/2010
Typ práce: disertační práce
Jazyk práce: angličtina
Ústav: Katedra fyziologie (31-152)
Vedoucí / školitel: RNDr. Hana Zemková, CSc.
Řešitel: skrytý - zadáno vedoucím/školitelem
Datum přihlášení: 15.03.2010
Datum zadání: 25.02.2013
Datum a čas obhajoby: 29.03.2013 09:00
Datum odevzdání elektronické podoby:25.02.2013
Datum proběhlé obhajoby: 29.03.2013
Oponenti: doc. RNDr. Viktorie Vlachová, CSc., DrSc.
  doc. RNDr. Zdeňka Bendová, Ph.D.
 
 
Předběžná náplň práce
Purinergní P2X receptory jsou membránové iontové kanály aktivované extracelulárnímATP. U savců bylo dosud nalezeno sedm různých podtypů, označovaných jako P2X1-7,které svojí stavbou představují rodinu ligandem řízených iontových kanálů svýjimečnými strukturně/funkčními vlastnostmi. Každý P2X receptor je tvořen třemipodjednotkami, kde každá podjednotka má dvě transmembránové domény.Krystalografická data ukazují, že pór iontového kanálu se nachází mezi druhýmitransmembránovými doménami. Krystalová struktura P2X4 receptoru zebřičky (Daniorerio) je dostupná pro receptor v uzavřeném a otevřeném stavu s navázanou molekulouATP, a proto je přesná struktura vazebného místa pro ATP vyřešena. Cílem tétodizertační práce bylo studium strukturně-funkčních vlastností v modelu rekombinantníhoP2X4 receptoru. Technikou bodové mutageneze a elektrofyziologickou technikou patchclamp byl zkoumán funkční význam pěti konzervovaných cysteinových párů v ektodoméně a funkční úloha aminokyselinových zbytků, které tvoří extracelulárnívestibul P2X4 iontového kanálu potkana. Všech deset cysteinů, jeden po druhém, bylonahrazeno alaniny nebo threoniny a ATP-stimulované proudy byly snímány z HEK293Tbuněk nesoucích divoký typ P2X4 receptoru nebo jeho mutace. Výsledky získané umutací C116A, C126A, C149A a C165A naznačují poruchu ATP-vazebné kapsy přinarušení jimi tvořených disulfidických můstků (C116-C126 a C149-C165A). Třetícysteinový můstek (C132-C159) se jeví jako nedůležitý. Na převodu signálu zektodomény k transmembránovým doménám či otevírání iontového kanálu se podílíčtvrý a pátý můstek (C261-C270 a C217-C227). Vzhledem k blízkosti cysteinové vazbyC217-C227 a brány pro průchod iontů jsme zkoumali také roli aminokyselinovýchzbytků v polypeptidových řetězcích V47-V61 a F324-N338, které formují extracelulárnívestibul P2X4 receptoru. Alaninové mutace v pozici F324, G325, V49, Y54 a Q55 mělyza následek nefunkční receptor, což naznačuje klíčovou úlohu těchto aminokyselin vefunkci receptoru. Ukázalo se, že V49 je důležitá pro expresi kanálu na povrchu buňky.Výměnou Y54 za jiné aromatické aminokyseliny (Y54W a Y54F) se podařilo vrátitfunkci receptoru, nikoli za nearomatickou (Y54L), což dokládá důležitost aromatickéhozbytku na této pozici. Funkci mutací Y54A a Y54C bylo možné částečně navrátit taképoužitím ivermektinu, alosterického modulátoru P2X4 receptoru, což ukazuje na sníženícitlivosti k ATP u těchto mutací. U aminokyselinového zbytku Q55 se nepodařilo nijaknavrátit funkci receptoru výměnou za jinou aminokyselinou, jediná mutace Q55E bylacitlivá k ivermektinu. Mutace F324L, F324Y a F324W částečně či kompletně obnovilyfunkci receptoru, byly citlivé vůči ivermektinu a změny v citlivosti těchto mutantůkorelovaly s velikosti a hydrofobicitou jejich řetězců. Další zasaženou aminokyselinuG325 se podařilo nahradit za prolin, což ukazuje na potřebu flexibilního ohybu v danémmístě receptoru. Následná topologická analýza ukázala, že G325 a F324 přerušují ponavázání ATP strukturu beta-listu. Výsledky prokazují mnohonásobnou úlohuaminokyselin v oblasti extracelulárního vestibulu ve funkci P2X4 receptoru.
Předběžná náplň práce v anglickém jazyce
Purinergic P2X receptors are membrane ion channels activated by extracellular ATP.There are seven isoforms of mammalian P2X receptors designated as P2X1-7, whichaccording to their structure represent a specific family of ligand gated ionic channels,with extraordinary structural/functional properties. The P2X receptor consists of threesubunits and each subunit has two transmembrane domains. Crystalographic datademonstrate that ionic channel pore is situated between the second transmembranedomains. Crystal structure of P2X4 receptor from the zebrafish (Danio rerio) is availablein both open and closed state of the channel and the exact structure of ATP binding site issolved. The aim of this thesis was to study the structure-function relationships in a modelof recombinant P2X4 receptor of the rat. By employing the point mutagenesis andelectrophysiological recording, the functional importance of conserved cysteine residuesin the ectodomain and amino acid residues which form the extracellular vestibule wasinvestigated. All ten cysteins were substituted one by one with alanine or threonine andATP-induced currents were measured from HEK293T cells expressing wild type (WT)and mutated P2X4 receptors. The results indicate that C116A, C126A, C149A andC165A mutations disrupt two disulfide bonds (C116-C126 and C149-C165A) which areneeded for the integrity of ATP binding site. The third disulfide bond (C132-C159) isfound as unimportant. The fourth (C217-C227) and the fifth (C261-C270) disulfide bondsare supposed to be important for either coupling of ligand binding and channel gating orchannel gating itself. Considering the close proximity of C217-C227 to the extracellularvestibule which forms the entrance for ions, the residues V47-V61 and F324-N338forming the lateral portals of vestibule were also investigated. Alanine mutations atpositions F324, G325, V49, Y54 and Q55 have yielded a non-functional receptorindicating that these residues are essential for receptor function. It has been shown thatV49 residue is important for expression of the channel on the cell surface. Thesubstitution of Y54 to any other aromatic residue (Y54W and Y54F) resulted in restoringthe receptor function, unlike non-aromatic residues (Y54L) which points out theimportance of aromatic residue at this position. Furthermore, the Y54A and Y54Creceptor function was partially rescued by ivermectin, a positive allosteric modulator ofP2X4 receptor, suggesting a rightward shift in the potency of ATP to activate thereceptor. In the case of Q55 residue, no substitution restored the receptor function; theonly rescue was made by treating Q55E with ivermectin. The F324L, F324Y, and F324Wmutations also rescued receptor function partially or completely, ivermectin action onchannel gating was preserved in all mutants, and changes in ATP responsivenesscorrelated with the hydrophobicity and side chain volume of the substituent. The G325Pmutant had a normal response to ATP, suggesting that G325 is a flexible hinge. Atopological analysis revealed that the G325 and F324 residues disrupt an ectodomain β-sheet upon ATP binding. These results indicate multiple roles of the extracellularvestibule amino acid residues in the P2X4 receptor function.
 
Univerzita Karlova | Informační systém UK