Analýza uspořádaní vazebné kapsy MDR pumpy Cdr1p patogenní kvasinky Candida albicans – hlavního přispěvatele ke klinické lékové rezistenci

• Název práce v češtině: Analýza uspořádaní vazebné kapsy MDR pumpy Cdr1p patogenní kvasinky Candida albicans – hlavního přispěvatele ke klinické lékové rezistenci
• Název v anglickém jazyce: Analysis of the arrangement of the binding pocket of the MDR pump Cdr1p of the pathogenic yeast Candida albicans - a major contributor to clinical drug resistance.
• Klíčová slova: mnohočetná léková rezistence|MDR pumpa|Cdr1p|vazebná kapsa|vazebné místo|azol|lék|substrát|kvasinka|Candida albicans|fluorescence|diS-C3(3) metoda|zónový test
• Klíčová slova anglicky: multidrug resistance|MDR pump|Cdr1p|binding pocket|binding site|azole|drug|substrate|yeast|Candida albicans|fluorescence|diS-C3(3) assay|disk diffusion test
• Akademický rok vypsání: 2020/2021
• Typ práce: diplomová práce
• Jazyk práce: čeština
• Ústav: Fyzikální ústav UK (32-FUUK)
• Vedoucí / školitel: doc. RNDr. Dana Gášková, CSc.
• Řešitel: Mgr. Tomáš Bartl - zadáno a potvrzeno stud. odd.
• Datum přihlášení: 23.03.2021
• Datum zadání: 23.03.2021
• Datum potvrzení stud. oddělením: 22.04.2021
• Datum a čas obhajoby: 08.02.2022 09:00
• Datum odevzdání elektronické podoby: 06.01.2022
• Datum odevzdání tištěné podoby: 06.01.2022
• Datum proběhlé obhajoby: 08.02.2022
• Oponenti: RNDr. Jan Krůšek, CSc.

Zásady pro vypracování

1. Prostudovat literaturu o mechanizmech rezistence kvasinek, o činnosti membránových transportérů včetně MDR pump, o membránovém potenciálu a o technice měření membránového potenciálu a aktivity MDR pump pomocí fluorescenčních sond v živých kvasinkových buňkách.
2. Zvládnout metodiku kultivace kvasinek Saccharomyces cerevisiae a biologických testů (zónový a výsevový test).
3. Pomocí zónových testů stanovit, které z testovaných substrátů se váží do stejného místa či míst ve vazebné kapse pumpy Cdr1p.
4. Optimalizovat diS-C3(3) fluorescenční metodu pro současné monitorování změn membránového potenciálu a aktivity pumpy Cdr1p indukovaných jejími substráty za použití kvasinky Saccharomyces cerevisiae (AD1-8u-) s heterologně exprimovanou MDR pumpou Cdr1p z Candida albicans.
5. Analyzovat koncentračně závislý inhibiční účinek řady běžných azolových substrátů Cdr1p (jako je flukonazol, ketokonazol, vorikonazol, ravukonazol, itrakonazol a mikonazol) na transport sondy zprostředkovaný pumpou Cdr1p.
6. Pomocí zónového testu se pokusit o nalezení modelových substrátů, tzv. benchmark substrátů, které se specificky vážou pouze do jednoho ze tří předpokládaných vazebných míst ve vazebné kapse Cdr1p.
7. Identifikovat vazebná místa ve vazebné kapse pumpy Cdr1p pro fluorescenční sondu diS-C3(3) a testované substráty.

Seznam odborné literatury

1. Holmes, A.R., Lin, Y.H., Niimi, K., Lamping, E., Keniya, M., Niimi, M., Tanabe, K., Monk, B.C. and Cannon, R.D. ABC transporter Cdr1p contributes more than Cdr2p does to fluconazole efflux in fluconazole-resistant Candida albicans clinical isolates. Antimicrob Agents Chemother. 2008, 52(11), 3851–62. 0066-4804.
2. Tsao, S., Rahkhoodaee, F. and Raymond, M. Relative contributions of the Candida albicans ABC transporters Cdr1p and Cdr2p to clinical azole resistance. Antimicrob Agents Chemother. 2009, 53(4), 1344–52. 0066-4804.
3. Holmes, A.R., Cardno, T.S., Strouse, J.J., Ivnitski-Steele, I., Keniya, M.V., Lackovic, K., Monk, B.C., Sklar, L.A. and Cannon, R.D. Targeting efflux pumps to overcome antifungal drug resistance. Future Med Chem. 2016, 8(12), 1485-501. 1756-8919.
4. Cannon, R.D., Lamping, E., Holmes, A.R. Niimi, K., Baret, P.V., Keniya, M.V., Tanabe, K., Niimi, M., Goffeau, A. and Monk, B.C. Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clin Microbiol Rev. 2009, 22(2), 291–321. 0893-8512.
5. Prasad, R. and Rawal, M.K. Efflux pump proteins in antifungal resistance. Front Pharmacol. 2014,5. 1663-9812.
6. Prasad, R. and Goffeau, A. Yeast ATP-binding cassette transporters conferring multidrug resistance. Annu Rev Microbiol. 2012, 66, 39-63. 0066-4227.
7. Prasad, R., Balzi, E., Banerjee, A. and Khandelwal, N.K. All about CDR transporters: Past, present, and future. Yeast. 2019, 36(4), 223-33. 0749-503X.
8. Prasad, R., Sharma, M. and Rawal, M.K. Functionally relevant residues of Cdr1p: a multidrug ABC transporter of human pathogenic Candida albicans. J Amino Acids. 2011, 2011. 2090-0112.
9. Nakamura, K., Niimi, M., Niimi, K., Holmes, A.R., Yates, J.E., Decottignies, A., Monk, B.C., Goffeau, A. and Cannon, R.D. Functional expression of Candida albicans drug efflux pump Cdr1p in a Saccharomyces cerevisiae strain deficient in membrane transporters. Antimicrob Agents Chemother. 2001, 45(12), 3366-74. 0066-4804.
10. Schuetzer-Muehlbauer, M., Willinger, B., Egner, R., Ecker, G. and Kuchler, K. Reversal of antifungal resistance mediated by ABC efflux pumps from Candida albicans functionally expressed in yeast. Int J Antimicrob Agents. 2003, 22(3), 291-300. 0924-8579.
11. Niimi, M., Wada, S., Tanabe, K., Kaneko, A., Takano, Y., Umeyama, T., Hanaoka, N., Uehara, Y., Lamping, E., Niimi, K., Tsao, S., Holmes, A.R., Monk, B.C. and Cannon, R.D. Functional analysis of fungal drug efflux transporters by heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae. Jpn J Infect Dis. 2005, 58(1),1-7. 1344-6304.
12. Niimi, K., Harding, D.R., Holmes, A.R., Lamping, E., Niimi, M., Tyndall, J.D., Cannon, R.D. and Monk, B.C. Specific interactions between the Candida albicans ABC transporter Cdr1p ectodomain and a D-octapeptide derivative inhibitor. Mol Microbiol. 2012, 85(4), 747-67. 0950-382X.
13. Tanabe, K., Lamping, E., Nagi, M., Okawada, A., Holmes, A.R., Miyazaki, Y., Cannon, R.D., Monk, B.C. and Niimi, M. Chimeras of Candida albicans Cdr1p and Cdr2p reveal features of pleiotropic drug resistance transporter structure and function. Mol Microbiol. 2011, 82(2), 416-33. 0950-382X.
14. Puri, N., Prakash, O., Manoharlal, R., Sharma, M., Ghosh, I. and Prasad, R. Analysis of physico-chemical properties of substrates of ABC and MFS multidrug transporters of pathogenic Candida albicans. Eur J Med Chem. 2010, 45(11), 4813–4826. 0223-5234.
15. Puri, N., Gaur, M., Sharma, M., Shukla, S., Ambudkar, S.V. and Prasad, R. The amino acid residues of transmembrane helix 5 of multidrug resistance protein CaCdr1p of Candida albicans are involved in substrate specificity and drug transport. Biochim Biophys Acta. 2009, 1788(9), 1752–61. 0005-2736.
16. Rawal, M.K., Khan, M.F., Kapoor, K., Goyal, N., Sen, S., Saxena, A.K., Lynn, A.M., Tyndall, J.D., Monk, B.C., Cannon, R.D., Komath, S.S. and Prasad, R. Insight into pleiotropic drug resistance ATP-binding cassette pump drug transport through mutagenesis of Cdr1p transmembrane domains. Biol Chem. 2013, 288(34), 24480-93. 1083-351X.
17. Lamping, E., Monk, B.C., Niimi, K., Holmes, A.R., Tsao, S., Tanabe, K., Niimi, M., Uehara, Y. and Cannon, R.D. Characterization of three classes of membrane proteins involved in fungal azole resistance by functional hyperexpression in Saccharomyces cerevisiae, Eukaryot Cell. 2007, 6(7), 1150–65. 1535-9778.
18. Saini, P., Prasad, T., Gaur, N.A., Shukla, S., Jha, S., Komath, S.S., Khan, L.A., Haq, Q.M. and Prasad, R. Alanine scanning of transmembrane helix 11 of Cdr1p ABC antifungal efflux pump of Candida albicans: identification of amino acid residues critical for drug efflux. J Antimicrob Chemother. 2005, 56(1), 77-86. 0305-7453.
19. Baghel, P., Rawal, M.K., Khan, M.F., Sen, S., Siddiqui, M.H., Chaptal, V., Falson, P. and Prasad, R. Multidrug ABC transporter Cdr1 of Candida albicans harbors specific and overlapping binding sites for human steroid hormones transport. Biochim Biophys Acta Biomembr. 2017, 1859(10), 1778-89. 0005-2736.
20. Szczepaniak, .J, Łukaszewicz, M. and Krasowska, A. Detection of inhibitors of Candida albicans Cdr transporters using a diS-C3(3) fluorescence. Front Microbiol. 2015, 6, 176. 1664-302X.
21. Gášková, D., Čadek, R., Chaloupka, R., Vacata, V., Gebel, J. and Sigler, K. Monitoring the kinetics and performance of yeast membrane ABC transporters by diS-C3(3) fluorescence. Int J Biochem Cell Biol. 2002, 34(8), 931-7. 1357-2725.
22. Čadek, R., Chládková, K., Sigler, K. and Gášková, D. Impact of the growth phase on the activity of multidrug resistance pumps and membrane potential of S. cerevisiae: effect of pump overproduction and carbon source. Biochim Biophys Acta. 2004, 1665(1-2), 111-7. 0005-2736.
23. Maláč, J., Urbánková, E., Sigler, K. and Gášková, D. Activity of yeast multidrug resistance pumps during growth is controlled by carbon source and the composition of growth-depleted medium: DiS-C3(3) fluorescence assay. Int J Biochem Cell Biol. 2005, 37(12), 2536-43. 1357-2725.
24. Hendrych, T., Kodedová, M., Sigler, K. and Gášková, D. Characterization of the kinetics and mechanisms of inhibition of drugs interacting with the S. cerevisiae multidrug resistance pumps Pdr5p and Snq2p. Biochim Biophys Acta. 2009, 1788(3), 717-23. 0005-2736.
25. Gášková, D., Plášek, J., Zahumenský, J., Benešová, I., Buriánková, L. and Sigler, K. Alcohols are inhibitors of Saccharomyces cerevisiae multidrug-resistance pumps Pdr5p and Snq2p. FEMS Yeast Res. 2013, 13(8), 782-95. 1567-1356.
26. Gášková, D., Brodská, B., Heřman, P., Večeř, J., Malínský, J., Sigler, K., Benada, O. and Plášek, J. Fluorescent probing of membrane potential in walled cells, diS-C3(3) assay in Saccharomyces cerevisiae, Yeast. 1998, 14(13), 1189–97. 0749-503X.
27. Ježíková, Z., Pagáč, T., Pfeiferová, B., Bujdáková, H., Dižová, S., Jančíková, I., Gášková, D. and Olejníková, P. Synergy between azoles and 1,4-dihydropyridine derivative as an option to control fungal infections. Antonie Van Leeuwenhoek, International Journal of General and Molecular Microbiology. 2017, 110(9), 1219-26. 0003-6072.
28. Černáková, L., Dižová, S., Gášková, D., Jančíková, I. and Bujdáková, H. Impact of farnesol as a modulator of efflux pumps in a fluconazole-resistant strain of Candida albicans. Microb Drug Resist. 2019, 25(6), 805-12. 1076-6294.
29. Zahumenský, J., Jančíková, I., Drietomská, A., Švenkrtová, A., Hlaváček, O., Hendrych, T., Plášek, J., Sigler, K. and Gášková, D.Yeast Tok1p channel is a major contributor to membrane potential maintenance under chemical stress. Biochim Biophys Acta Biomembr. 2017, 1859(10), 1974-85. 0005-2736.
30. Saini, P., Prasad, T., Gaur, N.A.et al. Alanine scanning of transmembrane helix 11 of Cdr1p ABC antifungal efflux pump of Candida albicans: identification of amino acid residues critical for drug efflux. J Antimicrob Chem. 2005, 56(1), 77–86. 0305-7453.
31. Shukla, S., Saini, P., Smriti, S., Jha, S., Ambudkar, S.V. and Prasad, R. Functional characterization of Candida albicans ABC transporter Cdr1p. Eukaryotic Cell, 2003, 2(6), 1361–75. 1535-9778.
32. Jančíková, I., Zahumenský, J., Gbelská, Y. and Gášková, D. Differences in the arrangement of the Pdr5p multidrug transporter binding pocket of Saccharomyces cerevisiae and Kluyveromyces lactis. FEMS Yeast Res. 2017, 17(7). 1567-1356.

Předběžná náplň práce

Candida albicans je podmíněně patogenní kvasinka, která se běžně vyskytuje kolem nás a je součástí lidského mikrobiálního osídlení, aniž by to člověka ohrozilo na zdraví. Běžná jednobuněčná forma kvasinky bývá neškodná, avšak za specifických podmínek se může přichytit na lidském těle a vytvoří mnohobuněčné vláknité útvary (tzv. hýfy), které jsou silně invazivní a patogenní. Pro osoby s oslabenou imunitou mohou různé formy infekce způsobená kvasinkou C. albicans skončit jejich smrtí.
Kromě nárůstu houbových infekcí se v nemocnicích stále častěji setkáváme s případy klinické lékové rezistence, kdy infekce přetrvává navzdory antimikrobiální terapii. Nejběžnějšími antimykotiky pro léčbu houbových infekcí jsou azoly (např. flukonazol, ketokonazol), protože se snadno podávají a mají jen málo vedlejších účinků. Ačkoliv mohou mít reziste<i>ntní klinické izoláty u převládajícího lidského patogenu, Candida albicans, více než jeden mechanizmus rezistence, je jejich vysoká rezistence na azoly nejčastěji způsobena nadměrnou expresí membránových transportních proteinů, tzv. MDR pump, které aktivně odstraňují léky z buněk a tím zabraňují tomu, aby jejich vnitrobuněčná koncentrace přesáhla toxickou úroveň. Jedna taková pumpa je schopna odstraňovat široké spektrum různých strukturně a funkčně odlišných látek, léků, a proto jsou tyto pumpy zodpovědné za fenomén zvaný „mnohočetná léková rezistence“ (anglicky MULTIDRUG RESISTENCE). Odtud vyplývá i jejich název = MDR pumpy.
Hlavními MDR pumpami podílejícími se na klinické rezistenci na azoly u patogenní kvasinky Candida albicans jsou ABC transportéry Cdr1p a Cdr2p, v některých případech i MFS transportér CaMdr1p.
Heterologní exprese MDR pump z Candida albicans v modelové kvasince Saccharomyces cerevisiae (AD1-8u-) poskytuje univerzální systém jak pro analýzu uspořádání vazebné kapsy těchto pump, tak pro vyhledávání jejich inhibitorů, které by umožňovaly chemosenzitizaci (tj. zvýšení citlivosti) rezistentních patogenních kmenů na azolová léčiva.

Hlavní náplní diplomové práce je analýza uspořádání vazebné kapsy MDR pumpy Cdr1p. Pro studium architektury kapsy bude použita celá řada jejich substrátů včetně fluorescenční sondy diS-C3(3) a bude sledována schopnost jejich vzájemné kompetitivní inhibice. K dosažení cílů práce bude použita jak diS-C3(3) fluorescenční metoda, vyvinutá v oddělení biofyziky na FÚ UK, tak biologické metody, zejména zónový test, který umožňuje stanovit nejenom to, zdali je látka substrátem pumpy, ale také zda se dva různé substráty váží do stejného vazebného místa nebo míst.
Práce má převážně experimentální charakter. Metodicky i materiálově je zabezpečena na Fyzikálním ústavu UK.