P2X7 receptory (P2X7) jsou extracelulárním ATP aktivované iontové kanály, které se nachází především na buňkách imunitního původu, gliových a epiteliálních buňkách. Patří do rodiny P2X receptorů, které mají podobnou strukturu: tvoří je dva transmembránové segmenty, velká extracelulární klička a intracelulární N- a C- konec. Jsou propustné pro Na+, K+ and Ca2+ ionty, P2X7 receptor však má neobvyklé biofyzikální vlastnosti iontového kanálu a unikátní schopnost propouštět velké biologicky aktivní molekuly, jako jsou cytokiny nebo ATP, nebo fluorescenčí barviva jako je ethidium bromid (EtBr). Po navázání ligandu dojde v molekule P2X7 receptoru ke konformačním změnám, jejichž výsledkem je otevření póru. V dlouhodobé přítomnosti ligandu se pór stabilizuje, elektrofyziologický proud narůstá a dochází k sensitizaci receptoru a pomalejšímu uzavírání iontového kanálu. Mechanismus zpomalení deaktivace nebyl dosud zcela objasněn. Předpokládá se, že rychlost a míra deaktivace je závislá na odvazování ligandu z extracelulárního vazebného místa, ale mohla by být také ovlivněna samotným mechanismem otevírání iontového kanálu, které je dílem interakce obou transmembránových domén. Cílem této diplomové práce bude zkoumat úlohu první transmembránové domény v deaktivaci P2X7 potkana. Budou vytvořeny alaninové mutace a proudy stimulované BzATP, specifickým ligandem pro P2X7, budou snímány technikou patch-clamp z HEK293T buněk exprimujících divoký typ P2X7 a jeho mutace. Kinetika deaktivace (tj. pokles proudu vyvolaný odmytím agonisty) bude vyhodnocována proložením jedné nebo dvou exponenciáních funkcí a zjišťováním deaktivační časové konstanty. U všech receptorových mutací bude měřena citlivost receptoru na agonistu, která bude charakterizována jako koncentrace BzATP vyvolávající 50% maximální odpovědi – EC50. U vybraných mutací, u kterých bude pozorována změna v kinetice deaktivace, bude zkoumána schopnost a rychlost akumulace EtBr do HEK293T buněk transfekovaných těmito receptory. Tato měření odhalí klíčové aminokyseliny v první transmembránové doméně, které přispívají k uzavírání iontového kanálu a jsou důležité pro na funkční vlastnosti buněk nesoucích P2X7 receptoru.
- zadáno a potvrzeno stud. odd.