Hedgehog signální dráha je významná signální dráha účastnící se řízení diferenciace embryonálních buněk, segmentace těla, vývoje mozku, skeletu, svalstva, gastroinestinálního traktu, plic, dále udržování a regenerace tkání dospělých. Dráha zahrnuje více než deset proteinů: receptorů, koreceptorů, ligandů, transkripčních efektorů a represorů, zapojených do komplexních funkčních interakcí. Porucha hedgehog signalizace během embryonálního vývoje může vést k závažné vývojové vadě - k holoprosencefalii. Mutace způsobující ztrátu funkce PTCH1 vedou ke Gorlinově syndromu - hereditární predispozici k basocelulárnímu karcinomu, asociovanému s anomáliemi mozku, lebky, obratlů a žeber. Bylo zjištěno, že holoprosencefalie i Gorlinův syndrom jsou geneticky heterogenní, mohou být způsobeny zárodečnými mutacemi různých genů Hedgehog signální dráhy. V letech 2006 - 2016 jsme v ÚBLG FN Motol analyzovali pro diagnostické účely gen PTCH1 u 70 nepříbuzných nemocných s podezřením na Gorlinův syndrom (MIM 109400). U 35 (50%) z nich jsme zjistili patogenní variantu genu PTCH1, u 10 nemocných, kteří splňovali diagnostická kriteria, a 25 nemocných, kteří kriteria nesplňovali, jsme příčinu onemocnění neprokázali. V letech 2008 - 2016 jsme analyzovali gen SHH z hedgehog signální dráhy a dále geny SIX3, ZIC2 a TGIF u 48 nepříbuzných nemocných nebo plodů s holoprosencefalií. Patogenní variantu v některém z vyšetřovaných genů jsme potvrdili v 12 případech (25%), z toho ve 4 případech v genu SHH (MIM 142945, MIM 600725). Předmětem diplomové práce bude ověřit, zda u dosud negativně testovaných nemocných s projevy Gorlinova syndromu nebo s holoprosencefalií není onemocnění způsobeno dosud neidentifikovanou patogenní variantou genu kódujícího protein hedgehog signální dráhy, zejména genu SUFU u Gorlinova syndromu a genu PTCH1 u holoprosencefalie. Po revizi klinických údajů a dostupnosti genomové DNA budou tyto geny analyzovány kombinací metod masivně paralelního sekvenování na analyzátorech HiSeq a MiniSeq (Illumina) a Sangerova sekvenování na genetickém analyzátoru 3130xL (Applied Biosystems), predikce patogenního charakteru zjištěných variant bude prováděna in silico. Očekáváme, že výsledky přinesou nové poznatky o příčinách Gorlinova syndromu a holoprosencefalie, zvýší úspěšnost genetické diagnostiky a tím zpřesní genetickou prognózu v rodinách s výskytem těchto chorob. Během řešení diplomové práce diplomantka zpracuje literární rešerši o současném stavu poznání proteinů Hedgehog signální dráhy, o dědičných onemocněních asociovaných s poruchami proteinů Hedgehog signální dráhy, s důrazem na Gorlinův syndrom (MIM 109400, MIM 601309, MIM 607035) a holoprosencefalii (MIM 142945, MIM 600725, MIM 610828, MIM 610829, aj.). S využitím nejnovějších poznatků navrhne vhodné kandidátní geny pro rozšíření molekulárně genetických analýz. S využitím dostupných informací na Ensemble Genome Browser, UCSC Genome Browser, GenBank připraví podklady pro NGS panel genů a samostatně navrhne primery pro PCR a Sangerovo sekvenování nově analyzovaných genů. Seznámí se s fenotypovými projevy studovaných onemocnění a provede výběr vyšetřovaného souboru na základě indikačních kriterií. Naučí se samostatně provádět izolaci DNA z krve a tkání a základní manipulace s DNA včetně stanovení koncentrace a čistoty. Zavede a optimalizuje PCR a Sangerovo sekvenování pro nově analyzované geny. Bude samostatně provádět PCR, Sangerovo sekvenování a detekci delecí/duplikací metodou MLPA nově analyzovaných genů. Bude participovat na laboratorní části NGS analýzy, seznámí se s postupy přenosu, uchování a analýzy dat. Bude provádět interpretaci zjištěných variant podle současných doporučení s využitím in silico metod. Vyhodnotí přínos NGS panelu genů pro molekulárně genetickou diagnostiku.
- zadáno a potvrzeno stud. odd.