Paralelní detekce virových agens v patogenezi autoimunitních onemocnění

• Název práce v češtině: Paralelní detekce virových agens v patogenezi autoimunitních onemocnění
• Název v anglickém jazyce: Highly multiplexed virus detection in research of multifactorial diseases
• Klíčová slova: virus; autoimunita; sekvenování nové generace; multiplex
• Klíčová slova anglicky: virus; autoimmunity; next generation sequencing; multiplex
• Akademický rok vypsání: 2016/2017
• Typ práce: diplomová práce
• Jazyk práce: čeština
• Ústav: Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
• Vedoucí / školitel: prof. MUDr. Ondřej Cinek, Ph.D.
• Řešitel: skrytý - zadáno vedoucím/školitelem
• Datum přihlášení: 05.10.2016
• Datum zadání: 02.11.2016
• Datum odevzdání elektronické podoby: 30.04.2018
• Datum proběhlé obhajoby: 31.05.2018
• Oponenti: RNDr. Martina Saláková, Ph.D.
• Konzultanti: Mgr. Lenka Kramná, Ph.D.

Předběžná náplň práce

Viry jsou považovány za možné spouštěče autoimunitních onemocnění jako diabetes 1. typu či celiakie, jasné důkazy však stále chybí. Publikace o asociaci enterovirů s iniciací diabetu 1. typu pocházejí zejména ze severských prediabetických kohort, zatímco jiné kohorty tyto nálezy nepotvrzují.

Recentní rozšíření metodik paralelního sekvenování přineslo revoluci do humánní genetiky a pozvolna mění i molekulární detekční metody ve virologii. Problematickým aspektem detekce virů je velká heterogenita jejich genomů a neexistence univerzální pan-virové molekulární signatury. Studie zkoumající asociaci virů s pozdějším rozvojem autoimunitních onemocnění jsou tak odkázány především na metagenomické sekvenování, jehož nedostatečná senzitivita, specificita a reproducibilita je známa.

Naše skupina se dlouhodobě zabývá detekcí a sekvenováním střevních virů jako možných spouštěčů diabetu 1. typu. Stejně jako ostatní skupiny pociťujeme potřebu paralelní specifické a senzitivní detekce velkého počtu definovaných virových agens - takovéto testy pro definovaná agens však nejsou pro naše kandidátní agens komerčně dostupné.

Formát sekvenování nové generace je pro vývoj takovýchto testů mimořádně vhodný. Dosud jediný publikovaný protokol využíval vychytávání virových sekvencí pomocí specifických sond, což je strategie vhodná u vysokých virových náloží, ale pravděpodobně selhávající u náloží nízkých. Navíc se jedná o techniky extrémně náročné na práci i finance.

Naším současným cílem je vytvořit a optimalizovat amplifikační panel detekující a sekvenující množinu kandidátních virů a virům podobných sekvencí, který by byl vhodný pro studie autoimunitních chorob. Panel by měl být snadno přizpůsobitelný různému počtu simultánně detekovaných agens a různému počtu vzorků v sekvenančním běhu. Naše strategie použije dvoukolového přístupu: v prvním kole proběhnou reakce detekující množinu kandidátních agens, v kole druhém potom k produktu dosyntetizujeme indexy a vnější adaptéry pro sekvenaci.

Úkolem diplomantky bude
- podílet se na definování množiny detekovaných virů a na designu primerů,
- provést optimalizaci PCR pro amplifikaci ze vzorků různé povahy,
- podílet se na optimalizaci protokolů paralelní sekvenace,
- aplikovat získaný protokol ve studiích diabetu 1. typu nebo celiakie,
- sepsat diplomovou práci

Výsledek práce bude publikován jako technická zpráva v mezinárodním tisku a bude využit v reálných kohortových studiích přirozené patogeneze zmiňovaných dvou chorob (finská DIPP a norská MIDIA). Umožní studentce setkání s molekulárně biologickými metodami v praxi, se zpracováním a statistickou interpretací jejich výsledků a bude dobrou přípravou studentky pro pozdější uplatnění v molekulárně biologické laboratoři.

Předběžná náplň práce v anglickém jazyce

Several autoimmune multifactorial diseases are presumably triggered by infectious exposures. At present, there is a multitude of methods for detection and quantification of infectious exposures in studies of such diseases: on one end of the spectrum it is the candidate approach which tests agent by agent using simple molecular assays, on the other end there are modern applications of mass sequencing assessing the whole microbial populations. While the description of bacterial profiles can be safely based on the existence of pan-bacterial sequences of the ribosomal DNA, nothing similar is available in viruses. Pan-viral metagenomic sequencing (i.e. sequencing of all nucleic acids in a sample mechanically enriched for virus-like particles) presently suffers from many problems inherent to any novel and rapidly developing technique - the first and most important is its considerable lack of sensitivity, specificity, and reproducibility.

Presently, a non-clinical scalable method is needed of accurate virus detection in specimens originating from large longitudinal cohorts of children at genetic risk for the studied condition as are type 1 diabetes or coeliac disease. Commercially available tests are not suitable, as they are aimed at clinically relevant pathogens which mostly do not overlap with candidate agents that are presumably capable of triggering autoimmunity. Development of novel multiplex assays is therefore warranted. Such assays should be highly sensitive and specific, encompass tens to hundreds of agents, and should be amenable to easy addition of novel candidate viruses.

Next generation sequencing is well suited as a detection format for such assays. Published data are available on methods where virus DNA is captured by complementary DNA probes - such a method will work well in stool samples, as gut is the primary site of virus replication. It is however very likely that such a hybrid capture strategy will entirely fail in blood where the virus quantities are by several orders of magnitude lower than in stool, and moreover the blood cells provide too high background signal of human DNA. An assay utilizing amplification techniques will therefore be needed.

The aim of the present work is to develop and optimize an amplification-based panel detecting a set of viruses and virus-like sequences suitable for epidemiologic research of autoimmune diseases. The panel should be scalable both in number of simultaneously detected agents, and in number of samples tested in a sequencing run. The strategy will utilize sets of tailed primers which will serve in specific amplification of agents; following to this amplification, a limited number of PCR cycles will serve for addition of sample-specific tags bearing also adaptors for next generation sequencing. Finally, tagged products from multiple samples will be mixed and sequenced.

The tasks of the student will include:
· testing the tagged amplification, and addition of the sequencing adaptors
· multiplexing of the assays
· comparisons of newly developed specific assays with previously obtained results of virome metagenomic sequencing or of capture probe based sequencing
· application of the novel assays in ongoing projects on type 1 diabetes and coeliac disease

The results of the work will be published as a technical report, and will be part of the epidemiologic papers from the two ongoing nested case-control studies (type 1 diabetes and coeliac disease).