Vývoj ligandů konstitutivního androstanového receptoru (CAR)

• Název práce v češtině: Vývoj ligandů konstitutivního androstanového receptoru (CAR)
• Název v anglickém jazyce: Development of novel Constitutive androstane receptor (CAR) ligands
• Klíčová slova: buněčné modely, CACO-2, hepatocyty, nukleární receptory, regulace bitransformačních enzymů
• Klíčová slova anglicky: Cellular models, CACO-2, hepatocytes, nuclear receptors, regulation of biotransformation enzymes
• Akademický rok vypsání: 2015/2016
• Typ práce: disertační práce
• Jazyk práce: čeština
• Ústav: Katedra farmakologie a toxikologie (16-16170)
• Vedoucí / školitel: prof. PharmDr. Petr Pávek, Ph.D.
• Řešitel: skrytý - zadáno vedoucím/školitelem
• Datum přihlášení: 02.10.2015
• Datum zadání: 02.10.2015
• Datum a čas obhajoby: 20.09.2019 00:00
• Datum odevzdání elektronické podoby: 17.07.2019
• Datum odevzdání tištěné podoby: 22.07.2019
• Datum proběhlé obhajoby: 20.09.2019
• Oponenti: prof. RNDr. Jiří Hudeček, CSc.

Zásady pro vypracování

Seznámení se se současnými buněčnými modely
Seznámení se s molekulárně biologickými metodami přípravy modifikovaných buněčných linií
Příprava modifikovaných linií CACO-2, experimentální práce s hepatocytárními modely
Získání výsledků, publikace výsledků, prezentace na mezinárodních konferencích
Obhajoba doktorské práce

Seznam odborné literatury

Awortwe C, Fasinu PS, Rosenkranz B. Application of Caco-2 cell line in herb-drug interaction studies: current approaches and challenges. J Pharm Pharm Sci. 2014;17(1):1-19. Review.

Volpe DA. Drug-permeability and transporter assays in Caco-2 and MDCK cell lines.
Future Med Chem. 2011 Dec;3(16):2063-77.

Guguen-Guillouzo C, Guillouzo A. General review on in vitro hepatocyte models and their applications. Methods Mol Biol. 2010;640:1-40.

Banerjee M, Robbins D, Chen T. Targeting xenobiotic receptors PXR and CAR in human diseases. Drug Discov Today. 2015 May;20(5):618-28.

aj.

Předběžná náplň práce

Buněčné modely jsou nezbytnou součástí preklinického vývoje léčiv i jejich formulací z pohledu studia přestupu přes bariéry a střevní absorpce a pro určení toxického potenciálu. Z tohoto pohledu jsou nejuznávanějším buněčným modelem CACO-2 buňky pro transportní permeační experimenty a různé buněčné modely odvozené hepatocytů pro testování toxicity.
Přestože jsou tyto modely široce respektovány a užívány, jsou spojeny s některými nevýhodami a limitacemi. Především je to dlouhodobá a náročná kultivace pro diferenciaci v případě CACO-2 linie, validace permeačních vlastností linie a nestabilní přítomnost efluxních transportérů.
V případě modelů odvozených od hepatocytů je pak problém s absencí metabolické biotransformační aktivity.
Ve svém doktorském projektu se kandidát zaměří na možnosti optimalizace těchto buněčných modelů a jejich aplikaci při studiu absorpce a toxického potenciálu léčiv nebo jako modelů pro studium přestupu formulací nukleových kyselin.

Cílem bude připravit takové buněčné linie odvozené od výše zmíněných linií, které by byly geneticky manipulovány tak, aby se svými vlastnostmi přiblížili střevnímu epitelu nebo diferencovaným hepatocytům nebo aby bylo snadné monitorovat jejich diferenciaci v průběhu kultivace.

K tomuto účelu budou použity zavedené molekulárně biologické metody (konstrukce DNA plazmidů a transfekce pomocí lipozómů nebo transdukce lentiviry, selekce clonů, ověřování exprese transgenu pomocí metod gene reporter assay, RT-PCR, Western blotting aj.).
Projekt bude navazovat, ať již metodicky nebo tematicky, na doktorskou práci Mgr. Smutného a Mgr. Hyršové.

Projekt bude zajištěn ze dvou projektů Grantové agentury ČR, především projektů P303/12/0472 Studium mechanizmů regulace biotransformačnícho enzymu CYP3A4 prostřednictvím posttranslačních modifikací nukleárních receptorů-význam pro terapii a projektu P303/12/G163 Centrum interakcí potravních doplňků s léčivy a nutrigenetiky.

Předběžná náplň práce v anglickém jazyce

Cellular models are a necessary part of preclinical drug development and their formulations in terms of the drug transfer across the barrier and the intestinal absorption and for determining toxic potential. From this viewpoint, Caco-2 cells are the most reputable in vitro model for transport and permeation experiments and various cell models derived hepatocytes are established for toxicity testing.
Although these models are widely respected and used, they are associated with some disadvantages and limitations. Above all it is a time consuming cultivation for differentiation in the case of Caco-2 line, and validation permeation characteristics of the line.
The models derived from hepatocytes have a problem with the absence of metabolic biotransformation activity.
In this doctoral project, the candidate will focus on the possibilities for optimizing these cell models and their application in the study of the absorption and potentially toxic drugs or as models for studying the transfer of drug or nucleic acid formulations.

The aim is to prepare such a cell line derived from the above mentioned lines, which have been genetically manipulated so that its properties are closer to the intestinal epithelium or differentiated hepatocytes.

For this purpose the candidate will use the established molecular biology methods (plasmid DNA constructs and transfection using liposomes or lentiviruses transduction, selection of clone, verifying expression of the transgene using methods of reporter gene assay, RT-PCR, Western blotting, etc.).