|
|
|
||
|
Poslední úprava: doc. RNDr. Ing. Vladimír Krylov, Ph.D. (23.02.2021)
|
|
||
|
Poslední úprava: doc. RNDr. Ing. Vladimír Krylov, Ph.D. (22.04.2015)
Jiří Paleček, Obecná zoologie, Praktická cvičení, III. část, skripta, 1989
Scot F. Gilbert, Developmental biology, 7th edition, 2003 |
|
||
|
Poslední úprava: doc. RNDr. Ing. Vladimír Krylov, Ph.D. (20.02.2019)
Forma zkoušky - zápočet spojený s kontrolou a hodnocením protokolů vypracovaných v rámci praktického cvičení |
|
||
|
Poslední úprava: doc. RNDr. Ing. Vladimír Krylov, Ph.D. (02.03.2016)
I. ČÁST - TRVALÉ PREPARÁTY
Vývojová stadia žáby Drápatky vodní - Xenopus laevis
Cíl: nakreslit, popsat a určit jednotlivá vývojová stadia Xenopus laevis
Předložená stadia:
1. oocyty 2. stadium 2 buněk 3. stadium 4 buněk 4. stadium 8 buněk 5. stadium 32 buněk 6. blastula 7. časná gastrula 8. střední a pozdní gastrula 9. neurula 10. stadium ocasního pupene 1 11. stadium ocasního pupene 2 12. pulec 1 13. pulec 2 14. pulec 3
Řezové preparáty
varle - Xenopus laevis fragment ovaria - Xenopus laevis varle - myš ovarium - myš oplozené oocyty Xenopus laevis - pronukleus (pigmentová stopa spermie) oplozené oocyty Xenopus laevis - samčí a samičí pronukleus - fúze pronukleí (pigmentová stopa spermie)
spermie:
myš čolek dešťovka kohout drápatka
II. ČÁST - ZRÁNÍ PRASEČÍCH OOCYTŮ A IN VITRO FERTILIZACE
Obecný background
Oogeneze u savců
Samičí pohlavní buňky u savů procházejí 3 důležitými stádii. 1. dělení, 2. růst, 3.zrání.
1. Dělení - mitotický vznik oogonií (počet založen před narozením)
2. Růst - syntéza proteinů, různých mRNA a dalších důležitých komponent pro časný embryonální vývoj. Společně s rostoucím oocytem dochází ke vzniku folikulu, který svou tekutinou brání zrání oocytu. Oocyt je většinou zastaven v prometafázi I meiotického dělení. (1. meiotický blok). Jádro se nazývá zárodečný váček (GV - Germinal Visicle).
3. Zrání - po ovulaci se oocyt uvolní z folikulu, čímž dojde k tzv. znovuzahájení meiozy. To se projeví rozpadem zárodečného váčku (GVBD-Germinal Vesicle Break Down) a posléze uspořádáním chromozómů do metafáze I. Po krátké anafázi I - telofázi I oocyt vyčkává na oplození většinou v metafázi II, kdy je možné pozorovat vyloučené 1. pólové tělísko. Přechody mezi jednotlivými fázemi jsou hlavně řízeny p34cdc2 a cyklinem B, které dohromady tvoří MPF (Maturation Promoting Factor). Hladina jeho aktivní formy je nejvyšší v metafázi I a hlavně v metafázi II. V období anafáze I - telofáze I je naopak hladina této formy nejnižší. U savců je oocyt až do oplození většinou zastaven v metafázi II (2. meiotický blok).
Oplození u savců
Spermie v pohlavním traktu samice u savců procházejí procesem kapacitace. Po té jsou schopné oplození. Ke kontaktu spermie a oocytu dochází zhruba v horní třetině vejcovodu. Spermie překoná vrstvy kumulárních buněk a po kontaktu se zónou pelucidou dochází k akrozomální rekaci (vylití proteolytických enzymů). Po průniku spermie do oocytu dochází k 1. rychlému bloku polyspermie (změna polarity oocytární memebrány). Po té dochází k vylití tzv. kortikálních granulí z oocytu (2. pomalý blok polyspermie) a dlouhodobému zabránění vazby a průniku dalších spermií. Průnikem spermie do oocytu dojde k jeho aktivaci oscilacemi Ca2+ iontů a k dokončení meiozi. Vzniká tak postupně samičí prvojádro. Současně hlavička spermie začíná dekondenzovat do podoby samčího prvojádra. U obu prvojader po té dochází k syntéze DNA. U savců, na rozdíl např. od ježovky, nedochází v tomto okamžiku k jejich fúzi ale k oddělené kondenzaci do chromozómů v rámci profáze. Po té jsou samčí a samičí chromozómy promíchány v ekvatoriální rovině a během anafáze a telofáze vznikají dvě pravá somatická jádra.
Praktická část
Zrání prasečích oocytů
Po uvolnění z prostředí folikulu dochází asi do 6 hodin k rozpadu zárodečného váčku (GVBD). Metafáze I je pozorovatelná mezi 20 - 24 hodinou. Metafáze II pak mezi 42-48 hodinou od izolace.
Úkol pro 1. den
Izolace prasečích oocytů z folikulů aspirační metodou.
Folikuly vaječníku nabodneme injekční stříkačkou s jehlou a odsáváme folikulární tekutinu, která obsahuje volné oocyty obalené vrstvami kumulárních buněk. Po té aspirovanou tekutinu přeneseme do 3 cm nebo 6 cm Petriho misky a podle potřeby folikulární tekutinu naředíme PBS+0,01% PVA (polyvinylalkohol).
Pod stereobinolupou skleněnou kapilárou nasáváme jednotlivé oocyty, které přenášíme do druhé 3 cm Petriho misky s 2 ml manipulačního média M2. Izolované oocyty prohlížíme pod stereobinolupou. Prasečí oocyty jsou tmavé (lipidová granula) a jsou obaleny několika vrstvami kumulárních buněk. Oocyty spočítáme a rozdělíme do dvou skupin. 1. skupina bude tvořena méně kvalitními oocyty a je určena pro fixaci po 24 hodinách kultivace (stádium metafáze I). Ve 2. skupině by měly být vysoce kvalitní oocyty (rovnoměrná cytoplasma a 3-5 vrstev kumulárních buněk. Ty necháme kultivovat 42-48 hodin do stádia metafáze II s následným in vitro oplozením kančími spermiemi.
1. skupinu oocytů přeneseme skleněnou kapilárou do 4 jamkové destičky s 500 ul média M199 se 4 mg/ml GPBoS (růstové proteiny bovinního séra) překrytého 500 µl parafinového oleje. Druhou skupinu obdobně přeneseme do druhé 4 jamkové destičky se stejným médiem. Po té obě destičky kultivujeme v termostatu při teplotě 38,5 °C a 5% CO2).
Úkol pro 2. den
Fixace 1. skupiny oocytů po 24 hodinové maturaci
Z termostatu vyjmeme 4 jamkovou destičku s oocyty určenými pro fixaci (1. skupina oocytů). Do každé z jamek napipetujeme á 25 ul 0,1% Hyázy (Hyaluridonáza) a zamícháme. Tento enzym rozvolní expandovaný kumulus a umožní odstranění jeho buněk. Asi po 3-5 minutách oocyty přeneseme do kapky manipulačního média M2 v 6 cm Petriho misce a odstraníme zbylé kumulární buňky protahováním tenkou skleněnou kapilárou. Po očištění si všímáme poměrně silné zóny pelucidy, která je dobře patrná při polovičním zástinu. Oocyty poté fixujeme následujícím způsobem.
Osušíme podložní sklo, které jsme vyjmuli z etanolové lázně. Podle velikosti krycího skla naneseme do budoucích rohů trochu vazelíny z připravené injekční stříkačky. Skleněnou kapilárou přeneseme očištěné oocyty do středu pole vymezeného vazelínou. Opatrně přiložíme očištěné krycí sklo a pinzetou jemně tlačíme na jeho rohy (v místech, kde se nachází vazelína). POZOR NA PŘÍLIŠNÝ TLAK - OOCYTY SNADNO PRASKAJÍ. Hotový preparát vložíme do kyvety s 12 ml fixáže (etanol:octová kyselina, 3:1).
Úkoly pro 3. den
1. In vitro fertilizace
Spermie určené pro in vitro fertilizaci označíme vitálním barvením jádra a mitochondrií (Hoechst 33258 + Mitotracker Red CMX Ros) následujícím způsobem.
Odpipetujeme 3 ml spermií do 10 ml zkumavky z modrým uzávěrem. Zkumavku centrifugujeme při 1.000 g (2.650 ot/min - centrifuga MPW-340) po dobu 5 minut. Pasteurovou pipetou odebereme supernatant a čistou Pasteurovou pipetou přidáme 7 ml sterilního PBS + 0,01% PVA z lahvičky. Vše důkladně zamícháme a centrifugujeme 5 minut při 1.000 g. Tento krok opakujemne ještě jednou. Na závěr odsajeme supernatant a spermie resuspendujeme ve 2 ml PBS + 0,01% PVA. K suspenzi přidáme 5 µl Mitotrackeru (40 µM roztok v DMSO) a 2 µl Hoechst 33258 (1 mg/ml). Vše důkladně zamícháme. Do 1,5 ml Eppendorfky napipetujeme 990 µl destilované vody. Ze suspenze odebereme 10 µl které přidáme do zkumavky s vodou a vše důkladně promícháme (spermie jsou nyní 100 x ředěné a jsou znehybněné). Takto vzniklá suspenze je určená pro počítání spermií. Zbytek původní suspenze necháme inkubovat 30-45 minut při 17°C.
Zjištění počtu spermií na ml provedeme následujícím způsobem. Ze suspenze (100 x ředěné) odebereme 10 µl a aplikujeme je mezi krycí a podložní sklo Burkerovy komůrky. Komůrku umístíme do mikroskopu a spočítáme spermie, které se nacházejí v 16 velkých čtvercových polích (oblast je ohraničena trojitou rýhou). Nepočítáme ty spermie, které leží mezi velkými čtverci. Postup opakujeme ještě 2 x na jiných místech Burkerovy komůrky. Výsledné tři hodnoty zprůměrujeme. Koncentraci spermií na ml provedeme podle následujícího vzorečku:
X = průměrný počet spermií v 16 velkých čtvercových polích x 15.625 x 100
Vysvětlení výpočtu:
Plocha jednoho velkého čtverce = 0,04 mm2 , hloubka komůrky = 0,1 mm
Objem tekutiny nad jedním velkým čtvercem = 0,04 x 0,1 = 0,004 mm3 (µl)
Objem tekutiny nad 16 velkými čtverci = 0,004 x 16 = 0,064 mm3 (µl)
Přepočet na 1 cm3 (ml) = 1000 / 0,064 = 15.625 (koeficient ve vzorečku)
Suspenzi jsme 100 x ředili. Proto je nutné výslednou hodnotu vynásobit 100 Mezitím, co část skupiny počítá spermie, zbylí členové očistí oocyty maturované 42-48 hodin od kumulárních buněk stejným způsobem jako v případě oocytů určených pro fixaci po 24 hodinách zrání. Očištěné oocyty pozorujeme pod stereobinolupou a pokoušíme se nalézt 1. pólové tělísko, které se nachází pod zónou pelucidou jako kulovitý útvar. Přítomnost pólového tělíska značí, že oocyt je maturovaný a zastavený v metafázi II.
Mezitím máme připravené vitálně značené spermie. Každá skupina bude mít k dispozici jednu jamku s 500 µl média mTBM se 2 mg BSA/ml (IVF médium). Ze suspenze značených spermií odebereme tolik µl aby po naředění do 500 µl mTBM média byla výsledná koncentrace 500.000 spermií/ml. Vše opatrně zamícháme a do jamky se spermiemi přidáme očištěné oocyty. Vše necháme inkubovat 1-2 hodiny v termostatu při teplotě 38,5 °C, 5% CO2. Po té pozorujeme kontakt obou gamet pod stereobinolupou a následně pod fluorescenčním mikroskopem. Hlavičky spermií jsou obarveny modře, krček a část mid-piece je značen červeně.
2. Barvení preparátů fixovaných oocytů po 24 hodinách maturace
Preparáty vyjmeme z kyvety s fixáží a osušíme spodní část podložního skla. 1 ml Pasteurovou pipetou naneseme malé množství acetoorceinu na horní hranu krycího skla. U spodní hrany odsáváme protékající tekutinu papírovou utěrkou. Pozorujeme jak se acetoorcein dostává od horní ke spodní hraně. Asi po 5 minutách naneseme na horní hranu krycího skla acetoglycerol a postupujeme stejně jako u acetoorceinu. Obarvení oocytů kontrolujeme pod stereobinolupou. Na závěr olemujeme krycí sklo lakem na nehty, který brání vysušování preparátu. Preparáty pozorujeme pod mikroskopem s fázovým kontrastem. Oocyt je zbarven do růžova. Chromozómy tvořící metafázi I jsou zbarveny karmínově červeně. Provedeme zákres preparátu.
III. ČÁST - EMBRYONÁLNÍ VÝVOJ C. ELEGANS
Háďátko Caenorhabditis elegans
Caenorhabditis elegans patří mezi volně žijící nepatogenní hlístice. V přírodě jej najdeme v půdě, kde se živí bakteriemi. U háďátka rozlišujeme dvě pohlaví – převažující hermafrodity se schopností samooplození (kombinace pohlavních chromozómů XX) a zřídka se vyskytující samce (0.05% populace, kombinace pohlavních chromozómů X0). V laboratoři je C. elegans významným modelovým organizmem. Na jedné straně je to reprezentant mnohobuněčných eukaryot, na druhé straně má jednoduché průhledné tělo, které umožňuje studovat celou řadu procesů přímo v živém organizmu. Háďátko se také snadno pěstuje v laboratoři a má krátkou generační dobu (3-4 dny). Embryonální vývoj je determinační, s přesně daným počtem buněk, takže je možné sledovat vývoj každé jednotlivé somatické buňky. Dospělý hermafrodit má 959 somatických buněk, zatímco u dospělého samce jich je 1031. Homeotické geny (Hox) kódují transkripční faktory, jejichž typickou součástí je evolučně konzervovaná DNA vazebná oblast nazývaná homeodoména. Hox geny hrají klíčovou úlohu v určení předozadní osy těla a v rozdělení těla na jednotlivé segmenty. U C. elegans došlo ke ztrátě některých Hox genů, navíc je zde exprese Hox genů více závislá na typu buněk než na konkrétní pozici v rámci těla. I přes tyto změny jsou Hox geny důležité pro určení osudu buněk. Vaším úkolem je detegovat expresi tří různých Hox genů v C. elegans: mab-5 (ftz, fushi tarazu), lin-39 (Scr, sex combs reduced or Hox5) and egl-5 (Abd-B, abdominal B). Dostanete linie háďátek nesoucí lacZ reporter, jehož exprese je vždy řízena promotorem jednoho z výše zmíněných genů.
• Spláchněte háďátka z petriho misky 800μl pufru M9 • Centrifugujte 1000g/30 sec ~ 3000 rpm / 30 sec., opatrně odsajte supernatant • Přidejte 800 μl dH2O, centrifugujte, opatrně odsajte supernatant • Sušte ve speedvacu 20 min. • Inkubujte ve 300 μl acetonu (na ledu) 2 min. 2x, vždy centrifugujte a odsajte supernatant • Nechte zbylý aceton vytěkat • Přidejte 250 μl barvicího roztoku, nechte vyvíjet, chraňte před světlem • Reakci zastavte přidáním 800 μl pufru M9, centrifugujte a odsajte supernatant • Zhotovte preparát a pozorujte pod mikroskopem
Barvicí roztok na 1ml 1M NaH2PO4 33 μl 0.5M Na2HPO4 332 μl 0.1M MgCl2 1 μl 0.3M K3Fe(CN)6 16.5 μl 0.3M K4Fe(CN)6 16.5 μl 1%SDS 4 μl 2% X-gal 12.5 μl 100% formamid 3 μl voda 581.5 μl
Exprese Hox genů v embryu C. elegans:
(Wang et al., 1993)
DAPI barvení
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) je fluorescenční barva vázající se na DNA, takže se využívá k barvení jednotlivých chromozómů i celých jader Vám toto jednoduché barvení umožní lepší orientaci v morfologii různých vývojových stádií háďátka.
• Spláchněte háďátka z petriho misky 800μl pufru M9 • Centrifugujte 1000g/30 sec ~ 3000 rpm / 30 sec., opatrně odsajte supernatant • Fixujte 300 μl metanolu (20 min., na ledu) • Centrifugujte, opatrně odsajte supernatant • Inkubujte ve 300 μl acetonu (10 min., na ledu) • Centrifugujte, opatrně odsajte supernatant • Promyjte 800 μl pufru M9, centrifugujte, opatrně odsajte supernatant • Zvířata resuspendujte v roztoku DAPI (1 μg/ml), chraňte před světlem!!! • Promyjte 800 μl pufru M9, centrifugujte, opatrně odsajte supernatant • Zhotovte preparát a pozorujte pod fluorescenčním mikroskopem
|